The precise regulation of cell growth and proliferation is mediated by various signaling pathways, whose dysfunction results in defective development and diseases like cancer. Using $\It{Drosophila}$ as a model organism, I identified novel cell growth regulators and investigated their physiological functions in vivo. 1) TOR signaling pathway regulates cell growth and metabolism in response to various nutrient signals by forming complexes with its two different partners, Rictor or Raptor. To distinguish the physiological roles of these complexes, I generated loss-of-function mutants of Rictor and Raptor in $\It{Drosophila}$. As a result, $\It{Rictor-deficient}$ flies showed decreased Akt-dependent tissue hyperplasia and Akt-Ser-505 phosphorylation. Consistently, FOXO-induced apoptosis, which is inhibited by Akt, was enhanced in $\It{Rictor}$ null mutants, indicating that $\It{Rictor}$ is essential for regulating Akt-FOXO signaling module. However, neither S6K-dependent cell growth nor S6K-Thr-398 phosphorylation was affected in $\It{Rictor}$ null mutants. On the other hand, knockdown of Raptor, another TOR binding partner, decreased S6K-Thr-398 phosphorylation and inhibited S6K-induced cell overgrowth. Collectively, these findings strongly suggest that Rictor and Raptor plays pivotal roles in TOR-mediated cell apoptosis and growth control by differentially regulating Akt- and S6K-dependent signaling pathways, respectively. 2) In response to nutrient starvation, bacteria synthesize ppGpp (guanosine 3’,5’-diphosphate) as a signaling alarmone to reduce cell growth and overcome the stress. The synthesis and degradation of ppGpp are mediated by RelA and SpoT enzymes. Although ppGpp signaling is broadly observed in prokaryotes, the identity of its eukaryotic counterparts has remained elusive. Here, I firstly identify functional SpoT homologs in human (hMesh1) and $\It{Drosophila}$ (dMesh1) and reveal their protein structures and biochemical characteristics. Similar to the bacterial SpoT, Mesh1 contains an active site for ppGpp hydrolysis and a conserved His-Asp (HD)-box motif for $Mn^{2+}$ binding. Consistent with these structural data, Mesh1 efficiently catalyzes ppGpp hydrolysis both in vitro and in vivo. Mesh1 also suppresses SpoT-deficient lethality and RelA-induced cell growth delay in $\It{ E. coli. }$ Strikingly, the deletion of $\It{ Mesh1 }$ in $\It{Drosophila}$ induces retarded body growth and impaired starvation resistance. Microarray analyses reveal that amino acid-starved Mesh1 null mutant displays highly downregulated DNA and protein synthesis-related genes and highly upregulated stress-responsible genes. Intriguingly, expression of bacterial RelA in $\It{Drosophila}$ phenocopies $\It{ Mesh1 }$ null mutant. These data strongly implicate the existence of the evolutionarily conserved SpoT-related signaling in animal kingdom. 3) Left-right (L-R) asymmetry is established by tightly regulated patterning processes whereby species develop precise morphological and functional arrangement. A failure to establish L-R axis leads to heterotaxy, a condition that is associated with organ laterality defects. $\It{UV irradiation resistance-associated gene (UVRAG)}$, a tumor suppressor that regulates autophagy and endocytic trafficking, is disrupted in patients with L-R axis malformation. However, how UVRAG regulates body axis formation remains unknown. Here, I report that $\It{Drosophila} \It{UVRAG}$ loss-of-function mutants show defective looping of internal organs and genitalia orientation, the primary markers for L-R body axis in adult flies. Genetic analysis showed that $\It{UVRAG}$-mediated regulation of Notch endocytic trafficking, rather than autophagy, is required for the proper body axis formation. UVRAG mutation in $\It{Drosophila}$ disrupts the endocytic degradation of Notch, leading to abnormal Notch signaling and thereby defective body axis formation: in contrast, downregulation of Notch expression rescues this UVRAG mutant phenotype. Furthermore, cells from an UVRAG-mutated heterotaxy patient and colon cancer tumor cells displayed similar defective endocytic trafficking and consequent accumulation and activation of Notch. Taken together, these data strongly suggest that UVRAG has an evolutionarily conserved role in L-R axis formation by regulating Notch endocytic trafficking. Moreover, $\It{UVRAG}$ loss-of-function mutant $\It{Drosophila}$ provides a premier model system that recapitulates important aspects of heterotaxy genetic disease in humans. Taken together, my studies on the in vivo functions of novel cell growth regulators, Rictor, Raptor, Mesh1 and UVRAG will be helpful to understand the complex network of growth control mechanisms in various patho-physiological conditions.
세포 성장은 다양하고 정교한 신호전달계에 의해서 조절되며 이러한 조절의 항상성이 깨지면 암과 같은 개체발생 상의 심각한 질병이 유발된다. 따라서 이러한 세포 성장 신호전달계를 보다 깊이 있게 이해하기 위해, 본 연구자는 새로운 세포 성장 조절자들을 찾고, 초파리 모델동물을 이용하여 이들의 생체 내 기능을 연구하였다. 1) TOR 신호전달계는 다양한 영양분과 호르몬에 반응하여 세포 성장과 물질 대사를 조절한다. 최근 TOR 단백질과 복합체를 이루어 TOR 기능을 조절할 것으로 예상되는 새로운 조절자로써 Rictor와 Raptor가 발견되었다. 이 두 복합체의 생체 내 기능을 연구하기 위해, 본 연구자는 Rictor와 Raptor 유전자가 결손된 초파리 모델 동물을 제작하였다. 그 결과, Rictor가 결손된 초파리는 TOR의 하위조절자인 Akt 발암유전자에 의한 조직 과증생과 Akt 단백질의 Ser-505 인산화현상이 관찰되지 않았다. 이와 일맥상통하게 Akt에 의해 억제되는 세포 사멸 유도 단백질인 FOXO에 의한 세포 괴사가 Rictor 결손 초파리에서 촉진되어, 생체 내에서 Rictor가 Akt-FOXO 신호전달체계를 조절한다는 것을 알 수 있었다. 반면 TOR의 하위 조절자인 S6K 단백질에 의한 세포 성장과 Thr-398 인산화는 Rictor 결손 초파리에서 영향을 받지 않았다. 이와 반대로 TOR와 또 다른 복합체를 형성하는 Raptor가 감소된 초파리에서는 S6K에 의한 세포 성장과 Thr-398 인산화가 감소되었다. 따라서 종합적으로 이 발견들은 Rictor와 Raptor 단백질이 생체 내에서 TOR와 다른 복합체를 이루어, TOR가 Akt-FOXO와 S6K에 의한 세포 사멸과 세포 성장을 각각 매개할 수 있도록 조절한다는 것을 제시한다. 2) 영양분 고갈에 반응하여 박테리아는 ppGpp라는 신호 조절자를 사용하여 세포 성장을 감소하고 스트레스를 이겨낸다. ppGpp의 합성과 분해는 RelA와 SpoT 효소에 의해 이루어진다. 그렇지만 ppGpp 신호전달계는 박테리아에서 중요하게 연구된 것에 반해, 고등 생물, 즉 동물계에서는 그 신호전달계의 존재 여부가 미지수로 남아있다. 본 연구자는 사람과 초파리에서 박테리아 SpoT의 상동 단백질이 있다는 것을 발견하여 Mesh1이라 명명하였으며 이들의 단백질 구조와 생화학적 특징을 연구하였다. 박테리아 SpoT와 유사하게 Mesh1은 ppGpp 분해 사이트를 가지고 있었으며, 망간 이온 결합을 위한 HD 모티프를 보존하고 있었다. 이러한 구조적 유사성과 일맥상통하게, Mesh1은 ppGpp를 생체 내/외에서 실제 분해하였다. 또한 Mesh1은 E. coli 대장균의 SpoT 결손과 RelA 과발현에 의한 세포 성장 결함을 정상으로 되돌려 놓을 수 있었다. 놀랍게도, Mesh1이 결손된 초파리는 개체 성장의 지연을 보였으며 영양분 기아에 따른 저항도가 손상되었다. 유전자 전체를 이용한 Microarray 분석을 통해, Mesh1 결손 초파리는 영양분 결핍에 따라 DNA와 단백질 합성에 관련된 유전자가 감소한 것과 스트레스 저항에 관련된 유전자의 발현이 증가한 것을 알 수 있었다. 또한, 초파리에 박테리아 RelA를 발현하여 Mesh1 결손 초파리의 표현형을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과들은 SpoT 신호전달체계가 동물계에도 존재함을 제시하며 이 신호전달계가 영양분에 따른 세포성장을 조절하고 있음을 알려준다. 3) 동물 발생에 있어 내장 좌우 비대칭 (L-R axis)의 형성은 다양한 모르포겐과 단백질의 배열을 통해 정교하게 이루어 진다. 이러한 좌우 비대칭 형성의 실패는 내장 변위라는 발생상의 질병으로 이어진다. 따라서 본 연구자는 L-R axis 형성의 기작을 이해하기 위해 암 형성과 내장 변위 이상을 보이는 환자에서 돌연변이 되어있는 UVRAG 유전자의 생체 내 기능을 연구하였다. UVRAG이 결손 초파리를 제작한 결과 내장의 회전과 이에 따른 L-R axis 형성이 손상되어 있었고 암이 발생되었다. 또한 UVRAG 결손 초파리는 자식 작용과 단백질 수송 기능이 손상된 것을 관찰할 수 있었는데, 유전학 기법을 통해 UVRAG의 L-R axis 형성 기능이 자식 작용과 독립적으로 단백질 수송을 조절을 통한 것임을 알 수 있었다. UVRAG 결손 초파리는 세포 성장 촉진 조절자인 Notch 단백질의 수송과 이에 따른 분해가 손상되어 있었고, UVRAG 결손 초파리에서 유전학 기법을 통해 Notch 단백질의 양을 줄일 경우 UVRAG 결손 초파리의 이상 기능을 정상으로 회복할 수 있었다. 또한 UVRAG이 돌연변이된 환자에서 분리한 세포에서 Notch의 수송과 분해가 손상되어 있는 것을 관찰하였다. 따라서 이러한 결과들은 UVRAG이 세포 성장 촉진자인 Notch 단백질의 수송과 분해를 통해 L-R axis를 형성하는 기능이 초파리와 사람에서 보존되어 있다는 것을 제시한다. 지금까지의 연구를 통해 본 연구자는 새로운 세포 성장 조절자인 Rictor, Raptor, Mesh1, UVRAG의 생체 내 기능과 관련된 신호전달체계를 밝혀내었으며, 본 연구를 통해 세포 성장 조절의 정교한 조절 기작과 보다 다양한 병리적 현상에 대한 이해가 기대된다.
