In response to epidermal injury, $\It{Parasilurus asotus}$, a catfish, secreted a strong antimicrobial peptide into the epithelial mucosal layer. The molecular mass of the antimicrobial peptide, named parasin I, was 2000.4 Da as determined by matrix associated laser desorption ionization mass spectrometry. The complete amino acid sequence of parasin I, which was determined by automated Edman degradation, was Lys-Gly-Arg-Gly -Lys-Gln-Gly-Gly-Lys-Val-Arg-Ala-Lys-Ala-Lys-Thr-Arg-Ser-Ser. Seventeen of the 19 residues in parasin I were identical to the N-terminal of histone H2A which implies that parasin I was cleaved off from the N-terminal of catfish histone H2A. Parasin I showed strong antimicrobial activity against a wide spectrum of microorganisms, without any hemolytic activity. Circular dichroism spectra of parasin I indicated a structural content of 11% $\alpha$-helix, 33% $\beta$ -sheet, and 56% random coils. Parasin I formed an amphipathic $\alpha$-helical structure (residues 9-17) flanked by two random coil regions (residues 1-8 and 18-19) in helix-promoting environments. Deletion of the lysine residue at the N-terminal [Pa(2-19)] resulted in loss of antimicrobial activity, but did not affect the $\alpha$-helical content of the peptide. The antimicrobial activity was recovered when the lysine residue was substituted with another basic residue, arginine $([R^1]Pa)$, but not with polar, neutral, or acidic residues. Progressive deletions from the C-terminal [Pa(1-17), Pa(1-15)] slightly increased the antimicrobial activity $(1-4 \mu g/ml)$ without affecting the a-helical content of the peptide. However, further deletion [Pa(1-14)] resulted in nearly complete loss of antimicrobial activity and a-helical structure. Confocal microscopic analysis and membrane permeabilization assays showed that parasin I and its analogs with comparable antimicrobial activities localized to the cell membrane and subsequently permeabilized the outer and cytoplasmic membranes. [Pa(1-14)] also localized to the cell membrane, but lost membrane-permeabilizing activity, whereas [Pa(2-19)] showed poor membrane-binding and membrane-permeabilizing activities. Our results indicate that the catfish may produce parasin I from its histone H2A by a specific protease upon injury to protect against invasion by microorganisms. Also the basic residue at the N-terminal is essential for the membrane-binding activity of parasin I, and the $\alpha$-helical structure is necessary for the membrane-permeabilizing activity. Therefore, this study provide new insight into designing peptides with even higher antimicrobial activity and increase understanding of the molecular mechanism of cell-killing action of antimicrobial peptides.
메기 ($\It{Parasilurus asotus}$)의 상피점액층에서 강력한 항균 효능을 가진 펩타이드 parasin I을 분리하였다. parasin I은 메기의 상피세포가 손상되었을 때 점액층으로 분비되는 항균펩타이드로서 19개의 아미노산(Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Gln-Gly-Gly-Lys-Val-Arg-Ala-Lys-Ala-Lys-Thr-Arg-Ser-Ser)으로 구성되어 있으며 그 분자량은 2000.4 Da 으로 조사되었다. parasin I 의 19개 아미노산 중 17개가 histone H2A의 N-terminal 아미노산 구성과 동일하므로, 메기의 histone H2A로부터 유래한 항균펩타이드로 보인다. parasin I의 항균력을 조사한 결과 다양한 미생물에 대하여 항균효과를 나타내었는데 그 효능이 magainin 2 보다 12-100 배 더 강력하였고 hemolysis 는 관찰되지 않았다. parasin I의 2차 구조는 11% $\alpha$-helix, 33% $\beta$ -sheet 과 56% random coil로 나타났으며 amphipathic $\alpha$-helix structure (residue 9-17)를 중심으로 그 양 끝에 2부분의 random coil region (residues 1-8 및 residue 18-19)을 가진 것으로 밝혀졌다. parasin I의 N-terminal에 있는 lysine을 제거한 [Pa(2-19)]은 a-helix 구조는 유지하고 있으나 항균력을 상실한 것으로 조사되었고, N-terminal에 있는 lysine을 arginine으로 치환한 $([R^1]Pa)$ 은 parasin I의 항균력을 그대로 유지하는 것으로 밝혀졌다. 또, N-terminal에 있는 lysine을 arginine과 같은 basic residue로 치환했을 때는 항균력을 유지하나, polar, neutral, 또는 acidic residue로 치환한 경우에는 항균력을 상실하는 것으로 나타났다. 한편, parasin I의 C-terminal에 있는 아미노산들을 순차적으로 제거한 [Pa(1-17)]과 [Pa(1-15)]의 항균력이 parasin I의 항균력 보다 다소 증가하는 경향을 보였고, 아미노산을 더 제거한 [Pa(1-14)]는 항균력과 $\alpha$-helix 구조를 완전히 상실하였다. confocal microscopic analysis 와 membrane permeabilization assay를 통하여 항균효능을 보이는 parasin I 과 그 analog들은 모두 bacterial cell membrane에 위치하고 있었고 outer membrane과 cytoplasmic membrane을 permeabilizing시키는 것을 확인할 수 있었다. [Pa(1-14)]의 경우는 cell membrane에 위치하기는 하나 membrane permeabilizing activity가 없었고, [Pa(2-19)]는 membrane binding activity와 membrane-permeabilizing activity를 모두 상실하였다. 이상으로부터 parasin I의 N-terminal에 있는 lysine이 membrane binding activity에 필수적인 아미노산임을 알 수 있었고, $\alpha$-helical structure가 membrane-permeabilizing activity에 필요한 것임을 알게 되었다. 그러므로 본 연구는 항균펩타이드의 분자구조와 작용기작과의 관계를 규명함으로써 강력한 효능을 가진 새로운 펩타이드의 개발을 도모할 수 있는 유용한 자료로 이용될 수 있음에 의의가 있다.
