Living cells must continually adapt to changing environments by altering their gene expression patterns. One of the central regulatory mechanisms is transcriptional regulatory interactions between transcription factors and their target genes. There have been many experimental and computational approaches to solve this problem. As an experimental approach, microarray data have been applied to find a set of genes believed to be co-regulated with a transcription factor. However, many co-regulated genes can be indirectly affected by the transcription factor. To verify whether a target gene is regulated directly or not, ChIP-on-chip technology has been widely adopted. However, since ChIP-on-chip data provide us approximate binding sites in genome-wide scale, the motif discovery process using computational programs is further required to identify exact binding motifs.
In this study, the transcriptional regulatory networks of Arabidopsis seed germination controlled by PIL5 were investigated by applying integrative analysis. PIL5 is a basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor that inhibits seed germination by regulating the expression of gibberellin (GA)- and Abscisic acid (ABA)-related genes either directly or indirectly. However, the comprehensive target gene networks and DNA-binding mechanisms are not yet known.
First, total 748 novel PIL5 binding sites in the $\It{Arabidopsis}$ whole genome were identified using Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-chip assay. Most of PIL5 binding sites were located in the promoter region consistent with its molecular function as transcription regulator. Gene expression profiling assay revealed that large numbers of gene expressions are regulated by PIL5 in response to light during seed germination. Comparison analysis of the ChIP-chip assay with the gene expressions profiling assay identified 166 PIL5 direct-regulated genes.
Second, the in vivo binding motifs of PIL5 were identified by Oligo-analysis combined with Kolmogorov-Smirnov test. Since commonly-used motif-finding programs such as AlignACE and MEME are based on strong-signal model, they are not efficient for identifying weakly overrepresented binding motifs. To overcome this, enrichment scores for all possible hexamers were calculated by applying binomial test. Then two-sample Kolmogorov-Smirnov test was performed between the distribution of given hexamers and that of G-box to filter out randomly enriched motifs. The result showed that most of the top-ranked binding motifs were either previously known ABREs or their coupling elements (CEs). In addition to this, most of previously known CEs are co-occurred with G-box and located within short distance from G-box suggesting that ABREs form a cluster around PIL5 binding sites.
Third, the comprehensive DNA-binding specificity analysis for PIL5 was performed. Previous study showed that PIL5 binds to the G-box (CACGTG) motif with high affinity and verified that many in-vivo binding sites contained G-box motif. However, since there are many randomly matched G-box motifs throughout the genome, other factors must account for the in vivo PIL5 binding specificity. The classification was performed to see if in vivo PIL5 binding sites can be explained by any attribute extracted from public databases as well as the result of our previous ChIP-chip assay. The results showed that PIL5 binding sites can be explained by attributes such as neighboring motif composition, nucleosome density, DNA methylation, and distance from transcription start site in addition to G-box. The Random Forest and SVM classifier using these attributes can classify PIL5 binding sites from non-binding sites with accuracy of 93.15% and 92.31% respectively.
살아있는 세포는 계속해서 변화하는 외부환경에 적응하기 위해서 외부로부터 전달되는 신호들을 감지하고 있다가 필요할 경우 이를 세포내부로 전달하여 세포 내 유전자들의 발현패턴을 변화시키는 시스템을 진화시켜 왔습니다. 세포 내부로 전달된 신호에 의해 유전자 발현이 변화되는 과정은 여러 단계에 의해 조절된다고 알려져 있지만, 전달된 신호가 초기에 확산되는 과정은 전사조절 인자를 통한 계층적 신호전달 기작을 이용하는 경우가 많습니다. 즉, 계층적 구조의 최상위에 존재하는 전자조절 유전자가 외부로부터 신호를 전달받은 뒤, 이를 다수의 하위 전사조절 유전자들에게 전달하면 빠른 속도로 세포 전체에 신호가 확산될 수 있습니다. 따라서 계층적 구조의 전사조절 네트워크를 통한 외부신호의 전달기작을 밝히는 연구는 세포의 기본적인 작동 메커니즘을 이해하는 데 아주 중요합니다.
본 연구는 여러 가지 생물학적 실험 데이터와 전산학적 기법들을 결합하여 전사조절 네트워크를 규명하는 방법론을 개발하고, 이를 식물에서 빛에 의해 종자발아가 촉발되는 과정에 관여하는 전사조절 네트워크를 밝히는데 적용하였습니다. 식물에게 종자의 발아과정은 이후의 생장과 번식의 성공여부를 결정짓는 중요한 순간이기 때문에, 종자는 다양한 외부 환경정보를 계속 감지하고 있다가, 최적의 순간이 오면 호르몬 신호를 통해 종자발아를 시작합니다. 애기장대의 종자발아는 빛 신호를 통한 지베렐린(gibberellin)과 앱식산(abscisic acid) 두 호르몬의 상호작용에 의해 조절된다고 알려져 있으며, 최근 PIL5 유전자가 빛 신호를 호르몬 신호로 바꾸는 최상위 유전자라는 것이 알려졌습니다.
먼저, ChIP-chip 분석을 통해 PIL5가 직접 결합하는 750개의 유전자를 유전체 레벨에서 동정하였습니다. 그리고, 유전자 발현양의 변화를 알아보는 microarray 실험결과와 비교하여 총 166개의 유전자가 PIL5에 의해 직접 조절되는 유전자라는 사실을 밝혔습니다. 또한 이들 PIL5 직접결합 유전자에 대한 기능분석을 통해, PIL5 유전자가 다양한 호르몬들의 합성 및 신호전달을 포괄적으로 조정하고, 세포벽 성질을 바꾸는 유전자들의 발현을 조절해서 발아를 억제한다는 사실을 알아냈습니다.
두 번째로, PIL5 유전자가 DNA에 결합하는 기작을 규명하기 위해 결합 모티프와 보조결합 단백질들을 동정하였습니다. PIL5는 이전 연구에서 G-box (CACGTG)에 결합한다고 알려져 있었으며, ChIP-chip 실험 데이터에서도 동일한 결과를 보여 주었습니다. 하지만, 유전체 상에 무작위로 존재하는 G-box 중에서 PIL5가 특정 G-box 만을 특이적으로 인지하기 위해서는 다른 보조 결합 단백질이 관여할 것으로 생각하여 G-box 외에 약하게 나타나는 모티프들을 검색한 결과 ABRE와 CE 모티프들이 많이 발견 되었습니다. 분석결과, PIL5 단백질은 G-box에 결합하며, 동시에 근처의 ABRE, CE 모티프에 결합하는 다른 보조 결합 단백질들과 상호작용 함으로써 DNA 결합 특이성을 획득하는 것으로 보입니다.
마지막으로 PIL5가 DNA에 결합하는데 있어, 결합 모티프와 같은 유전적 (genetic) 정보 외에 다른 epigenetic 요소들이 영향을 미치는지 알아보기 위해 기계학습 방법을 통해 여러 가지 요소들의 영향력을 비교해 보았습니다. 분석결과, 가장 영향력이 큰 요소는 G-box와 다른 ABRE, CE 모티프들의 효과를 함께 고려한 motif score 였고, 두 번째 요소는 nucleosome의 존재밀도였습니다. 이 같은 사실은 genetic 요소뿐만 아니라 epigenetic 요소가 PIL5의 DNA 결합에 많은 영향을 미친다는 것을 말해 주고 있습니다.
