Localization of a fluorescent nanoparticle has been widely used for studying biophysical processes, such as the diffusion of protein in cell membrane or the movement of molecular motors. A method to measure the three dimensional position change of fluorescent single particles designed for an epi-fluorescence microscope is presented.
A fluorescence particle is small enough to be assumed as a point source. In general, the two dimensional intensity distribution of a point source is well approximated by a Gaussian. Therefore, we obtained the fluorescence intensity of the fluorescent particle and matched it to a Gaussian curve. The positional resolution in the image plane was less than 4 nm with 100 ms temporal resolution. To verify the positional resolution of this measurement method, I compared the result of the fluorescence measurements with the capacitive sensor measurements.
In this thesis, the measurement of a nanotube cantilever’s deflection with a few nanometers scale is described. We attached fluorescent dyes at the end of a nanotube cantilever to detect its deflection. The nanotube cantilever, which can be used for generating and sensing piconewton forces in air or even liquid environments, consists of an individual multi-walled carbon nanotube (MWNT) attached to an electrochemically etched Tungsten tip and fluorescent particles at the end of the nanotube. Electorostatic actuation was carried out to bend the MWNT cantilever artificially up to $10 \microm$. Fluorescent particles were then tracked in the inverted fluorescence microscope system with nanometer resolution. This study provides an effective measurement technique of a nanocantilever sensor for monitoring the manipulation of biomolecules. Also, this technique can be applied to a manipulator or a force transducer on related a few piconewton forces.
For the measurement of the z-position of a particle, Fresnel diffraction pattern for a Gaussian aperture was evaluated to describe the intensity distributions of the fluorescence particle at different heights. With defocus, the spot diameter is getting large according to the longer distance from the focus. An algorithm to measure the z-position of a fluorophore from the amplitude and spot diameter of the fluorescence intensity is presented. Also, fluorescence intensity is getting weak. Fundamental experiment results demonstrated that the three-dimensional position of the fluorescent particle can be measured by the fluorescence measurement on a few nanometer scale with just one image.
본 연구는 형광 측정법을 이용하여 단일 형광 나노입자의 3차원 나노미터 스케일 위치 측정 시스템 개발이 목표이고, 구체적으로는 공간 분해능 수 nm, 시간 분해능 수 십 msec 이하로 측정하는 것이다. 이를 위해 시스템이 비교적 간단한 동시 형광법을 이용하여 형광입자의 3차원 위치를 측정하는 방법을 제안하고 이 방법에 대한 이론적인 측정 정확도를 예측한다. 또 실험을 통해 3차원 위치 측정 오차를 정량적으로 분석한다.
동시 형광법을 사용한 이유는 시스템이 간단하여 일반적인 광학 현미경에서도 구현 가능하고, 기존의 공초점 현미경의 강한 레이저 광원의 출력으로 인해 생체분자에 생기는 열 손상을 줄이며, 전반사 형광 현미경의 단점인 좁은 관찰 영역과 3차원 영상 추출의 제약을 해결하고, 스캐닝 필요 없이 한 장의 형광 이미지로부터 형광 입자의 3차원 위치를 측정하기 위함이다.
이 기술의 적용 예로 최근 단일 생체분자의 조작 및 기계적 특성 분석을 위한 나노 소재로 각광 받고 있는 탄소나노튜브(CNT, Carbon Nano-Tube) 끝단에 형광 나노입자를 부착시키고, 정전기력을 이용하여 탄소나노튜브에 굽힘 변위를 가하고 본 형광 측정법을 이용하여 나노조작 과정을 모니터링 한다. 이렇게 제작된 나노튜브 캔틸레버와 본 측정법이 결합하여 기존에는 측정할 수 없었던 극미세 힘(수 pN 정도) 측정 센서로 사용될 수 있음을 보이고 최소 힘측정 분해능을 계산한다. 또한 나노 스테이지를 이용하여 생체분자의 3차원 운동을 모사하고 이를 본 연구에서
제안한 방법으로 측정함으로써 생체분자의 3차원 운동 궤적 측정이 가능함을 보인다.
■ 형광 나노입자의 2차원 위치측정
· 평면에서 단일 형광입자의 위치측정 오차 분석
· 실험을 통한 나노미터 스케일 위치측정 오차 검증
· 평면에서 형광입자의 위치 측정 응용 : 나노 캔틸레버 굽힘변위 측정
■ 형광 나노입자의 수직 방향 위치측정 방법 제안
· 광축 방향 변위에 따른 형광의 세기 분포 모델링
· 형광 이미지 분석을 통한 광축 방향 위치 측정법 제안
· 형광입자의 수직 방향 위치측정 오차 분석
■ 생체 단분자의 3차원 운동 분석 가능성 검증
· 생체 단분자의 3차원 운동 모사
· 생체 단분자에 대한 3차원 운동 궤적 측정 가능성 검증'
