In this thesis, a multiwall nanotubes probe (MWNT probe) is proposed as a novel mechanical force transducer for single biomolecule force spectroscopy. Despite its high aspect ratio, and nanometer size, there had been no report on the usage of nanotube probes for single biomolecule mechanical experiment, because of hydrophobic nature and lack of high resolution measurement technique in aqueous conditions.
The MWNT probe, in this study, consisted of an individual MWNT attached to the tungsten electrode and fluorescent nanoparticles at tube’s end. The fluorescent nanoparticles including multiple dyes and a single nanoparticle were attached to the functionalized end of the MWNT via noncovalent hydrogen bonds. The role of the fluorescent nanoparticles is (i) to measure the deflection of the nanotube probe during single molecule force spectroscopy and (ii) to attach target biomolecules with their biomolecule conjugates.
Electrostatic actuation was employed to experimentally investigate the spring constant of an MWNT probe by analyzing the deflection of the nanotube using fluorescence measurement. The deflection of the nanotube was measured by sub-pixel localization of the fluorescent nanoparticles imaged onto charge-coupled device camera (CCD camera). Also, the length dependence of the spring constant was studied by adjusting the length of MWNT via electrochemical etching. The results showed that the spring constant of the as-fabricated MWNT probe was as small as 0.001 N/nm and tunable in the range of 0.001~0.05N/m.
Physical absorption of ethylenediamine vapor onto an MWNT probe rendered the nanotubes hydrophilic, which enabled manipulation of the MWNT probe in liquid environment without bending or buckling. Nanometre displacement of the MWNT probe in aqueous conditions was calibrated by photoelectrical signal ratio from a quadrant photomultiplier tube sensor (PMT sensor). The measurement system based on PMT sensor showed less than 10nm and 1msec in spatial and time resolution respectively.
The binding force of biotin/streptavidin bonds, as a model ligand/receptor, was measured using a MWNT probe as a force sensor. A microbead with biotin conjugates was prepared on the coverglass as a specimen. The MWNT probe with streptavidin conjugates of fluorescent nanoparticles was manipulated in liquid in order to come into contact with the microbead. By manipulating the nanotube using nanostage with a constant velocity, we measured the binding force of the bonds which is a product of the spring constant and the tip deflection of the nanotube.
Based on the first application of the nanotube probe to the single biomolecule research, the MWNT probes will be used in other single biomolecule mechanical experiments where the mechanical force is relevant, such as investigation of the mechanical properties of biomolecules, protein folding pathway, and protein-protein interaction.
본 논문은 다중벽 탄소나노튜브 프로브를 단일 생체분자 힘 분광법에서의 기계적 힘 센서로 제안하고, 이에 대한 연구를 수행하였다.
탄소나노튜브는 나노미터의 크기와 높은 세장비로 인하여 미세 힘을 측정할 수 있는 캔틸레버의 형태의 힘 센서로 각광을 받아왔다. 특히, 피코-나노뉴턴 크기의 힘이 관여하는 생체분자 대상 실험의 기계적 조작 및 측정 도구로 매우 적합하다고 여겨졌지만, 아직까지 그 응용에 대한 보고는 발표되지 않고 있다. 주요한 이유는 탄소나노튜브가 생체 분자가 존재하는 버퍼 용액 환경에 부적합한 소수성의 특징을 가지고 있으며, 용액 환경에서의 나노튜브의 변위를 측정할 수 있는 측정방법이 현재까지 부족하기 때문이다.
본 연구에서 제안된 탄소나노튜브 프로브는 개별의 다중벽 탄소나노튜브가 텅스텐 마이크로 전극의 끝에 결합되어 있고, 나노튜브의 끝에 형광 입자가 결합된 구조를 가진다. 형광입자로는 다수의 형광염료 혹은 단일 형광 나노입자가 이용되었으며, 수소결합 기반의 비공유결합을 통하여 기능화된 탄소나노튜브의 끝단에 선택적으로 접착된다. 형광입자의 역할은 단일 생체분자 힘 분광법 동안의 나노튜브의 휨 변위를 형광 측정을 통하여 측정할 수 있게 하며, 그 주변에 분자 접착제를 가지고 있어 목표 생체 분자와의 접착을 가능하게 한다.
단일 생체 분자 힘 분광법을 통한 미세 힘 측정을 위해서는 힘 센서로 사용되는 탄소나노튜브 프로브의 스프링 상수의 측정이 매우 중요하다. 본 연구에서는 나노튜브의 정전구동을 분석함으로써 실험적으로 스프링 상수를 측정하였다. 정전 구동에 의한 탄소나노튜브의 휨 변위는 나노튜브 끝단의 형광입자의 위치 변화를 계산함으로써 측정되었다. 측정 카메라의 면에 이미징된 형광입자 세기 분포에 대하여 가우시안 분포를 적용, 형광 세기 분포의 중심을 형광입자의 중심으로 정의하였다. 이로부터 단위 픽셀 레벨이하의 측정 정확도로 전압 조건에 대한 형광입자의 중심의 이동 거리를 구할 수 있게 되며, 이를 만족하는 나노튜브 프로브의 스프링 상수를 최적화 과정을 거쳐 구할 수 있다. 또한 제작된 나노튜브 프로브의 길이를 바꾸어 가면서 길이에 대한 스프링 상수의 영향을 살펴보았다. 결과적으로 제작된 탄소나노튜브 프로브는 0.001N/m 수준의 스프링 상수를 가지며, 정전 구동을 통하여 0.001-0.5N/m의 범위의 스프링 상수를 측정하였다.
나노튜브 프로브의 소수성 문제를 해결하기 위하여 본 연구에서는 친수성 기체 분자인 에틸레디아민 기체분자를 나노튜브 표면에 흡착시키는 방법을 적용하였다. 이를 통하여 용액 환경에서도 나노튜브 프로브가 휨이나 부러짐없이 안정적으로 조작됨을 확인하였다. 또한 분할 PMT 센서를 기반으로 하는 나노미터 변위 측정 시스템을 구축하여 용액내에서의 나노튜브 프로브의 이동 변위를 측정하였다. 제안된 시스템은 10nm이하의 측정 정확도, 1msec의 시간 분해능으로 나노튜브의 이동 변위를 측정할 수 있음을 확인하였다.
제안된 미세 힘 측정용 센서인 탄소나노튜브 프로브의 응용으로, 대표적인 리간드/리셉터 결합인 바이오틴/스트랩트아비딘 결합의 결합력 측정 실험을 수행하였다. 바이오틴이 그 주변에 결합된 마이크로 비드를 커버 글라스 위에 고정시킨 뒤, 스트랩트아비딘이 부착된 형광염료를 가진 나노튜브 프로브를 버퍼 용액 환경에서 구동하여 접착을 이룬다. 일정속도로 나노튜브 프로브를 후퇴시키면서 동시에 나노튜브의 휨 변위를 측정하였다. 이 과정에서 작용되는 힘의 크기는 사용한 탄소나노튜브 프로브의 스프링 상수와 그 휨 변위의 곱으로 계산되며, 이는 접착 과정시 이루어진 바이오틴과 스트랩트아비딘 결합의 결합력에 해당된다. 본 연구에서는 다수의 바이오틴과 스트랩트아비딘이 결합된 수 nN크기의 결합력이 측정되었다.
본 연구는 탄소나노튜브 프로브를 단일 생체 분자 힘 분광법에 적용한 첫번째 시도로서 나노튜브 프로브를 이용한 생체 분자의 기계적 실험 구성을 위한 준비 및 시스템 구축에 대한 내용을 선보였다. 본 연구 결과를 바탕으로 시료 준비과정, 단일 생체 분자간 결합등의 부분에서의 고찰 등을 통하여 기계적 힘이 관여하는 다른 생체분자 실험(예: 단백질/단백질 상호작용, 단백질 폴딩 현상, 생체분자의 기계적 특성 추출)에 나노튜브 프로브가 많이 활용되어 기존의 마이크로 캔틸레버 기반의 측정 연구에 비해 향상된 결과를 선보일 것으로 기대된다.
