The ribonucleoprotein enzyme RNase P was initially characterized as a tRNA-processing enzyme that removes extraneous 5´ sequences from precursor tRNAs to generate mature 5´ termini. Escherichia coli RNase P is composed of a large RNA subunit (M1 RNA) and a small protein subunit (C5 protein). In this thesis, first, it was investigated whether C5 protein plays a role in maintaining metabolic stability of M1 RNA. The sequestration of C5 protein available for M1 RNA binding reduced M1 RNA stability in vivo, and its reduced stability was recovered via overexpression of C5 protein. In addition, M1 RNA was rapidly degraded in a temperature-sensitive C5 protein mutant strain at nonpermissive temperatures. Collectively, the results demonstrate that the C5 protein metabolically stabilizes M1 RNA in the cell. Analysis with various RNase mutants strains suggests that RNase PH is involved in the turnover of free M1 RNA.
Cis-acting elements that might affect RNA stability were also investigated. For this purpose, M1 RNA, which is a highly stable RNA, was used as a model system. To find motifs essential for M1 RNA stability, M1 RNA derivatives lacking specific motifs or mutated were constructed and analyzed for their in vivo stabilities. The results suggest that the P1 stem structure is the most important element for maintaining M1 RNA stability, and then the P14 and P17 stem-loops are the next.
Since both subunits are assembled in a 1:1 ratio, expression of M1 RNA and C5 protein should be coordinately regulated for RNase P to be efficiently synthesized in the cell. However, it is not known yet how the coordination occurs. In this thesis, it was investigated how overexpression of C5 protein affects expression of the rnpB gene encoding M1 RNA, using a lysogenic strain, which carries an rnpB-lacZ transcription fusion. Primer extension analysis of rnpB-lacZ fusion transcripts showed that the overexpression of C5 protein increased the amount of the fusion transcripts, suggesting that rnpB expression increases with the increase of intracellular level of C5 protein. In various lacZ fusion strains with different rnpB promoter regions, the change of intracellular levels of rnpB-lacZ fusion transcripts after inducing C5 protein was analyzed using primer extension analysis. The results suggest that the rnpB promoter sequence of positions -50 to +168 is sufficient to the increase of rnpB transcription by C5 protein.
M1 RNA is produced in the cell by transcription of the rnpB gene and subsequent processing at the 3' end. The 3' flanking region of rnpB contains repeated sets of overlapping sequences coding for small proteins. The issue of whether these proteins are expressed remains to be established. Finally, this thesis showed that a small protein encoded by the first repeat within the 3’ flanking region of rnpB could be expressed in the cell. Interestingly, protein expression was increased at lower temperatures. The termination efficiency of rnpB terminators was decreased at lower temperatures, suggesting that anti-termination is responsible for enhanced protein expression. Moreover, the purified small protein contained M1 RNA, implying a role as a specific RNA-binding protein. Microarray data using a mutant strain lacking the expression of the small protein suggest that the absence of the small protein leads to the decrease of the expression level of garPLRK transcripts whose genes are located upstream of rnpB. This result implies that small protein may play a role in controlling the run-through transcription unit into the rnpB transcription unit.
대장균의 RNase P는 M1 RNA와 C5 protein으로 이루어진 리보핵산단백질(ribonucleoprotein)이다. M1 RNA는 리팜피신 추적 실험 결과에서 약 50분 정도의 반감기를 가지는 매우 안정한 RNA이다. 본 연구에서는 M1 RNA의 안정성에 필수적인 모티프(motif)를 찾기 위해 M1 RNA의 이차구조에서 줄기-고리 결실되거나 파괴된 다양한 돌연변이 M1 RNA들을 제작하였다. 여러 가지 종류의 돌연변이 M1 RNA들의 안정성을 측정한 결과, P14와 P17 고리 구조가 M1 RNA가 안정성을 유지하는데 있어서 필수적인 시스 인자(cis-element)임을 알 수 있었다. 또한 P1 줄기 구조가 파괴된 M1 RNA는 반감기를 측정할 수 없을 정도로 빠른 속도로 분해되었다. 이는 P1 줄기구조는 M1 RNA의 안정성을 유지하는데 가장 중요한 모티프라는 것을 의미한다.
M1 RNA가 안정성을 유지하는데 있어서 트랜스 인자(trans-element)로써 C5 protein의 역할을 알아보고자 하였다. 이를 위해 C5 protein과 결합할 수 있는 특정 줄기-고리 구조가 파괴된 M1 RNA를 과발현시켜서 세포 내에서 C5 protein 을 효과적으로 고갈시켰고, 이때 C5 protein과 결합하지 못한 M1 RNA의 안정성은 크게 감소하였다. 여기에 C5 protein을 과발현 시키면 M1 RNA의 안정성은 다시 회복되었다. 따라서 C5 protein은 M1 RNA가 안정성을 유지하는데 있어서 필수적이다. 또한 C5 protein과 결합하지 못한 M1 RNA는 exonuclease인 RNase PH에 의해 분해가 촉진되었다.
RNase P는 M1 RNA와 C5 protein이 1:1로 이루어져 있기 때문에 생체내에서 RNase P를 효율적으로 합성하기 위해서는 C5 protein과 M1 RNA의 합성이 공동 조절되어야 한다. 본 연구에서 M1 RNA의 합성이 세포 내 C5 protein에 의하여 어떻게 영향을 받는지를 rnpB-lacZ 전사 융합 (transcription fusion)을 가지고 있는 λ 용원성 균주 (lysogenic strain)를 이용하여 조사한 결과 C5 protien을 과발현 시켰을 때 rnpB 전사 활성은 증가하였다. 또한 C5 protein이 고갈되어도 rnpB 의 전사에는 변화가 없었다. 이 결과는 C5 protein이 자유형태 (free form)로 존재할 때는 rnpB 전사를 활성화시킬 수 있지만, 리보핵산 단백질로 존재할 때는 rnpB 전사를 활성화시키지 못한다는 것을 시사한다. 그러므로 리보핵산단백질로 회합되지 않아 여분으로 존재하는 C5 protein은 자기 자신의 리보핵산단백질 형성에 필요한 M1 RNA의 합성을 촉진시키기 위하여 rnpB 전사를 활성화시킨다는 모델을 제시할 수 있다.
M1 RNA는 rnpB 유전자의 전사체로부터 가공되어 합성되는데 rnpB 유전자의 3′측면 염기서열 영역에는 종결유전자 (factor-independent terminator) 3개가 연속해서 반복되어있다. 이러한 종결유전자는 113 의 염기쌍 반복단위 (repeated unit)안에 존재한다. 이 단위는 rnpB 유전자의 전사 개시점으로 부터 +354 위치에서 시작되어 3.5 배가 반복되어있다. 두 번째 반복되는 단위에는 두 개의 작은 단백질을 코드할 수 있는 ORF (open reading frame: 코딩 영역)이 겹쳐져 존재한다. 본 연구에서는 두 번째 종결인자를 포함하는 코딩 영역의 중첩되는 서열 중 첫 번째 영역에서 38개 아미노산의 작은 단백질 (ORF1)이 세포내에서 발견된다는 사실을 처음으로 밝혔다. 또한 ORF1 단백질은 세포내 M1 RNA와 결합하고 있다.
