Part 1
The reversible protein phosphorylation by kanases and phosphatases in signal transduction pathways regulates biological functions involved in cellular processes. One of phosphatases, protein tyrosine phosphatase (PTP) catalyzes the hydrolysis of the phosphate monoesters specifically on tyrosine residues and members of the PTP family regulate a variety of cellular processes including cell growth, differentiation, mitotic cell cycle, and oncogenic transformation. Several protein tyrosine phosphatases (PTPs) have been implicated in various diseases and have emerged as one of therapeutic targets. One of protein tyrosine phosphatases (PTPs), phosphatase of regenerating liver (PRL) family has been known to be associated with tumorigenesis and cancer metastasis. However, intracellular signal and biological function of phosphatase of regenerating liver (PRL) family are not clearly elucidated. Recently, it has been reported that phosphatase of regenerating liver (PRL)-1 and phosphatase of regenerating liver (PRL)-2 are involved in the enhanced cell cycle through a decrease in protein level of p21, one of p53 targets, and phosphatase of regenerating liver (PRL)-3 activate PI3K/Akt signaling during promoting the epithelial-mesenchymal transition (EMT). The effects of phosphatases of regenerating liver (PRLs) on p21 expression and PI3K/Akt activation suggest that phosphatases of regenerating liver (PRLs) may be correlated with the levels of the p53 protein regulating p21 expression and related with AKT signaling-mediated mouse double minute 2 (MDM2) phosphorylation. Therefore, I investigated the potential relationship between phosphatase of regenerating liver (PRL)-1 and p53. Most of the p53 target genes, all except mouse double minute 2 (MDM2), constitutively photomorphogenic 1 (COP1), and p53 induced protein with a RING-H2 domain (PIRH2), take functions in apoptosis, senescence, differentiation, anti-angiogenesis, and cell cycle arrest. The previously mentioned oncogenes downregulate p53 through a negative feedback mechanism, and thus contribute to cancer development. In this thesis, I report a new p53 target, PRL-1, which is believed to be a significant regulator in the development and metastasis of various cancer types. Overexpression of phosphatase of regenerating liver (PRL)-1 reduced the levels of endogenous and exogenous p53 proteins, and inhibited p53-mediated apoptosis. In contrast, the ablation of PRL-1 by siRNA increased p53 protein levels. The downregulation of p53 was mediated by p53 ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Furthermore, p53 ubiquitination by PRL-1 was achieved through two independent pathways, by inducing the level of PIRH2 transcription and by inducing the amount of mouse double minute 2 (MDM2) phosphorylation via Akt signaling. Moreover, I demonstrated that the PRL-1 gene harbors a p53 response element in the first intron, and its transcription is modulated by the p53. These findings suggest that the new oncogenic p53 target, PRL-1, may contribute to tumor development by the downregulation of p53 via an indirect negative feedback mechanism.
Part 2
The role of phosphatase of regenerating liver (PRL)-1 protein in developmental signalling pathways in vivo has not been examined. Therefore, I have investigated the expression and function of dPRL-1 during Drosophila development. The dPRL-1 is widely expressed in embryonic to adult tissues in Drosophila, while the gene is slightly over-expressed in early and pupa stage and specifically upregulated in brain, midgut, and fat body. Using gain-of-function and null mutants of dPRL-1, its physiological role was successfully characterized in Drosophila. I demonstrate an essential role for dPRL-1 in embryo to pupa development and survival, and a tissue-specific role in specification of wing vein thickness and extra vein. These results seemed to be caused through activation of Notch and bone morphogenetic protein (BMP) signaling and inactivation of Wnt Wingless (Wg) by dPRL-1 overexpression. These interactions may be relevant to studies implicating dPRL family proteins in tumorigenesis.
Part 1
세포의 성장, 분화, 이동, 사멸 등 각종 생리현상들을 조절하는 세포내 신호전달기작은 단백질 인산화반응 등을 통한 세포내 단백질 활성조절에 의해 제어되며, 이 조절기작상의 이상은 암을 비롯한 각종 질병의 원인이 되고 있다. 이러한 단백질의 인산화를 조절하는 두 가지의 효소가 kinase와 phosphatase인데, 이들 중 단백질의 탈인산화를 촉매 시켜주는 것이 phosphatase이며 포유동물에서 현재까지 알려진 phosphatase는 아미노산 중에서 serine/threonine이나 tyrosine에 특이적으로 작용하는 것으로 알려지고 있다. 이러한 phosphatase 중, 본 논문에서는 tyrosine에 특이적으로 작용하는 Phosphatase of Regenerating Liver (PRL, 또는 Protein Tyrosine Phosphatase type 4A; PTP4A) family의 세포 내 신호전달 기작 연구 및 초파리를 이용한 동물모델에서의 표현형을 연구하였다. 최근 보고에 의하면 Phosphatase of Regenerating Liver (PRL)는 유방암, 대장암, 간암, 췌장암 등 여러 가지 암조직에서 과발현되며, 정상세포에 과발현 시 암을 유발하고 암전이를 촉진시키는 암유발유전자로 보고되고 있고, 암억제유전자인 Phosphatases and Tensin Homolog (PTEN)을 불활성화 시켜 PI3K/Akt 신호를 활성화시키는 것으로 알려지고 있다. 이러한 Akt의 활성은 p53 단백질의 분해를 촉진하는 Mouse Double Minute 2 (MDM2)를 인산화시켜 MDM2의 기능을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 또한 PRL (PTP4A) family가 p53 전사인자의 타겟유전자인 p21의 활성을 감소시킨다고 보고되고 있어 p53과 PRLs family 유전자의 상관관계가 있을 것으로 사료되어 이들의 관계를 실험적으로 알아보고자 하였다. 실험적 결과로써, p53 전사인자는 PRL-1 유전자의 인트론 1 부분에 직접 결합하여 PRL-1 유전자의 전사를 조절하고, 반면에 PRL-1 유전자의 세포내 과발현은 p53 단백질의 안정성에 관여하는 Mouse Double Minute 2 (MDM2)와 p53 Induced protein with a RING-H2 domain (PIRH2)를 활성화시켜 p53 단백질을 ubiquitination 시키고 분해과정으로 유도하는 결과를 도출하였다. 이때에 PRL-1에 의한 MDM2의 활성은 PI3K 활성에 의한 AKT의 인산화가 MDM2 인산화를 유도함으로써 MDM2 단백질을 활성화 시켰으며, PRL-1에 의한 PIRH2의 활성은 Rho GTPase를 통해 Serum Response Factor (SRF)가 활성화되고, 이는 Early Growth Response 1 (EGR1)과 Early Growth Response 2 (EGR2)의 전사를 촉진하였으며, EGR은 PIRH2의 인트론 1부분에 결합하여 PIRH2의 전사를 조절하여 PIRH2의 과발현을 유도하였다. PRL-1의 p53 단백질에 대한 억제효과는 p53에 의해 유도된 세포사멸이 PRL-1의 과발현에 의해 억제되는 표현형으로 검증하였다. 이러한 p53과 PRL-1 유전자의 상호관계는 기존에 p53 negative feedback 조절유전자로 알려진 Mouse Double Minute 2 (MDM2), Constitutively Photomorphogenic 1 (COP1), p53 induced protein with a RING-H2 domain (PIRH2)와는 유사하지만, p53 분해과정에 관련된 MDM2와 PIRH2 유전자를 이용하는 측면에서 볼 때 간접적인 유형의 새로운 p53 negative feedback 조절유전자로 분류될 수 있을 것이다.
Part 2
Phosphatase regenerating liver (PRL) 유전자가 알려진 이후 지난 10여년간 수백편의 많은 논문들이 보고되고 있으나, 현재까지 PRL (혹은 protein tyrosine phosphatase type 4A; PTP4A) family의 형질전환 및 돌연변이 동물모델이 보고된 바가 없기에 초파리를 이용한 동물모델에서 PRL-1에 의한 표현형 관찰과 함께 유전자의 기능을 알아보고자 하였다. PRL-1 형질전환 초파리를 제조하여 유전자를 날개에서 특이적으로 과발현 시켰을 때 vein 세포수가 증가하면서 extra vein과 vein thickness를 확인하였으며, PRL-1의 발현을 억제시킨 돌연변이 초파리는 배아단계와 pupa 시기에 치사되는 양상을 나타내었다. 초파리의 날개 발생에 관여하는 5가지의 신호전달경로가 현재까지 보고되고 있는바, 각 신호전달 경로에서 중요하게 작용하는 마커들을 형질전환 초파리의 애벌레단계 (larva)에서 확인한 결과, Wnt/beta-catenin, Notch, BMP 신호전달 체계가 활성 또는 억제됨을 관찰하였으며, 이러한 3가지 신호전달 경로에 PRL-1이 영향을 주어 extra vein과 vein thickness형성에 관여했을 것으로 사료된다. 암형성 및 암전이에 관련된 것으로 알려져 있는 이러한 PRL (PTP4A) family에 대하여 세포 내 신호전달 기작을 규명하고 초파리를 이용한 형질전환 및 돌연변이 동물모델을 확립함으로써, 향후 PRL (PTP4A) family를 항암치료의 마커로 이용하여 새로운 항암제를 개발하는 데에 용이하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
