Recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells are one of the most popular hosts for therapeutic protein production. For the purpose of higher protein production, numerous strategies have been tried by means of enhancing specific protein productivity (q) and increasing the time integral of viable cell density. Enhancing viable cell density considering time could be achieved by either/both enhanced culture longevity and/or improved specific growth rate ($\mu$). In this study, for this end, we investigate the effect of Bcl-xL, XIAP, and CA-Ras overexpression on cell growth and protein production in rCHO cells.
Overexpression of Bcl-xL in rCHO cells has been known to suppress apoptotic cell death and thereby extend culture longevity during batch culture. However, its effect on q of rCHO cells is controversial. This study attempts to investigate the effect of Bcl-xL overexpression on q of rCHO cells producing erythropoietin (EPO). To regulate the Bcl-xL expression level, the Tet-off system was introduced in rCHO cells producing EPO (EPO-off-Bcl-xL). The Bcl-xL expression level was tightly controlled by doxycycline concentration. To evaluate the effect of Bcl-xL overexpression on specific EPO productivity ($q_{EPO}$) at different levels, EPO-off-Bcl-xL cells were cultivated at the two different culture temperatures, 33℃ and 37℃. The $q_{EPO}$ at 33℃ and 37℃ in the presence of 100 ng/mL doxycycline (without Bcl-xL overexpression) were 4.89±0.21 and 3.18±0.06 $\mu g$ / $10^6$ cells / day, respectively. In the absence of doxycycline, Bcl-xL overexpression did not affect $q_{EPO}$ significantly, regardless of the culture temperature, though it extended the culture longevity. Taken together, Bcl-xL overexpression showed no significant effect on the $q_{EPO}$ of rCHO cells grown at 33℃ and 37℃.
Upon nutrient deprivation during culture, rCHO cells are subjected to two types of programmed cell death (PCD), apoptosis and autophagy. To investigate the effect of Bcl-xL overexpression on apoptosis and autophagy in rCHO cells, an EPO-producing rCHO cell line with regulated Bcl-xL overexpression (EPO-off-Bcl-xL) was used. The expression level of Bcl-xL in EPO-off-Bcl-xL cells was tightly regulated by doxycycline in a dose-dependent manner. Bcl-xL overexpression enhanced cell viability and extended culture longevity in batch culture. Upon nutrient depletion in the later stage of batch culture, Bcl-xL overexpression suppressed apoptosis by inhibiting the activation of caspase-3 and caspase-7. Simultaneously, Bcl-xL overexpression also delayed autophagy, characterized by LC3-II accumulation. Immunoprecipitation analysis with a Flag-tagged Bcl-xL revealed that Bcl-xL interacts with Bax and Bak, essential mediators of caspase-dependent apoptosis, as well as with Beclin-1, an essential mediator of autophagy, and may inhibit their pro-cell death function. Taken together, it was found that Bcl-xL overexpression inhibits both apoptosis and autophagy in rCHO cell culture.
A cell culture with sodium butyrate (NaBu) addition is a widely used method for high-level protein production in rCHO cells; however, there is a limitation in the industrial application due to its detrimental effect on cell growth and apoptosis. To improve the applicability, the down-regulation of effector molecules in apoptosis such as caspase-3 and/or caspase-7 has been attempted and it showed limited success. For better improvement in inhibiting NaBu-induced apoptosis, caspase-9, of which activation induces the activation of caspase-3 and caspase-7, may also need to be down-regulated. To do so, we introduced XIAP gene, known as inhibitor of caspase-3, caspase-7, and caspase-9, into rCHO cells and an EPO-producing rCHO cell line with regulated XIAP overexpression (EPO-off-XIAP) was established using the Tet-off system. Unlike aggregate formation in GFP-tagged XIAP, full-length XIAP without any tagging did not form aggregation in rCHO cells. The XIAP overexpression was tightly regulated by doxycycline addition and XIAP overexpressed in EPO-off-XIAP cells could inhibit the activation of caspase-3, caspase-7, and caspase-9, simultaneously. However, XIAP overexpression did not affect cell growth and EPO production significantly, regardless of NaBu concentration added. Also, DNA fragmentation assay revealed that XIAP overexpression could not inhibit NaBu-induced apoptosis. Taken together, it was found that XIAP overexpression could inhibit the cleavage of caspases, caspase-3, caspase-7, and caspase-9; however, it could not relate to the blockage the NaBu-induced apoptosis in rCHO cells.
Upon growth promoting stimuli, Ras is activated and leads to induction of various signaling cascade including PI3K/Akt and MAPK/ERK signaling pathway related with cell growth and cell protection. At first, we figured out the twelfth amino acids is an important position for constructing constitutively active Ras (CA-Ras) in rCHO cells. To evaluate the effect of CA-Ras overexpression on cell growth in rCHO cells, an EPO-producing rCHO cell line with regulated CA-Ras overexpression (EPO-off-CA-Ras) was established using the Tet-off system. CA-Ras overexpression could increase the viable cell density at the late exponential phase, although it could not affect the specific growth rate and maximum cell density. On days 5 and 6, the viable cell density in the cells overexpressing CA-Ras were (2.92±0.14)×$10^6$ cells/mL and (3.02±0.09)×$10^6$ cells/mL, while it were (2.70±0.05))×$10^6$ cells/mL (2.80±0.07))×$10^6$ cells/mL in the cells non-overexpressing CA-Ras. Unexpectedly, CA-Ras overexpression could activate the MAPK/ERK signaling pathway, not PI3K/Akt signaling pathway, in rCHO cells. Taken together, it was found that CA-Ras overexpression increases the viable cell density at the late exponential phase by activation of the MAPK/ERK signaling pathway in rCHO cells.
재조합 Chinese hamster ovary(CHO)세포는 치료용 단백질 생산에 있어서 가장 널리 사용되고 있는 숙주세포 중 하나이다. 고농도의 치료용 단백질 생산을 목적으로, 비생산성(q) 향상과 시간이 고려된 총세포수(time integral cell density) 증가를 통한 수많은 전략들이 시도되고 있다. 시간이 고려된 총세포수의 증가는 배양 기간의 증가나 세포성장속도($\mu$) 증가를 통해 성취될 수 있다. 다음의 목적을 가지고 본 연구를 통해 Bcl-xL, XIAP, CA-Ras 과발현이 세포성장과 단백질 생산량에 미치는 영향성을 조사하였다.
재조합CHO세포에서 Bcl-xL의 과발현은 세포자살(apoptosis)을 막아주고 회분배양 (batch culture)시 배양 기간을 늘려주는 것으로 알려져 있다. 그러나, Bcl-xL의 과발현이 재조합CHO세포의 비생산성에 미치는 영향성은 여전히 논쟁의 여지가 있다. 본 연구 에서는 Bcl-xL의 과발현이 EPO를 생산하는 재조합CHO세포주의 EPO 비생산성 ($q_{EPO}$)에 대해 미치는 효과에 대해 조사하였다. Bcl-xL의 발현을 조절하기 위해 EPO를 생산하는 재조합CHO세포에 tet-off 시스템을 도입하여 EPO-off-Bcl-xL세포주를 확립 하였다. Bcl-xL의 발현은 독시사이클린(doxycycline)에 의해 정확하게 조절됨을 확인했다. 다른 조건하에서Bcl-xL의 과발현이 EPO 비생산성에 미치는 영향성을 평가하기 위해, EPO-off-Bcl-xL 세포주를 다른 배양 온도인 33℃와 37℃에서 각각 배양하였다. 100 ng/mL 독시사이클린이 첨가된 조건, 즉 Bcl-xL이 과발현되지 않은 조건하에서의 EPO 비생산성은 각각 4.89±0.21 $\mu g$ / $10^6$ cells / day와 3.18±0.06 $mu g$ / $10^6$ cells / day였다. 비록 Bcl-xL의 과발현이 배양 기간을 연장할지라도, Bcl-xL의 과발현은 배양 온도에 상관없이 EPO 비생산성에 의미있는 영향을 미치지 않는다. 결론적으로, Bcl-xL과발현은 33℃와 37℃에서 배양된 재조합CHO 세포의 EPO 비생산성에 의미 있는 효과를 나타내지 않는다.
배양 기간중 영양분이 고갈된 상황하에서, 재조합CHO세포는 두 종류의 다른 세포예정사(programmed cell death)인 세포자살(apoptosis)과 세포자가 포식(autophagy) 을 겪는다. Bcl-xL의 과발현이 세포자살과 세포자가포식에 미치는 영향성을 조사하기 위해, Bcl-xL이 조절 발현되며 EPO를 생산하는 EPO-off-Bcl-xL 세포주를 사용하였다. EPO-off-Bcl-xL 세포주는 Bcl-xL의 발현을 독시사이클린(doxycycline)의 농도에 의존적으로 정확하게 조절한다. 회분배양(batch culture)시 Bcl-xL 과발현은 세포생존율을 증가시키며 배양 기간을 연장한다. 회분 배양의 후반기에 영양분이 고갈된 상황하에서, Bcl-xL 과발현이 카스파제-3(caspase-3)과 카스파제-7(caspase-7)의 활성을 저해할 수 있다는 사실을 통해 세포자살을 막을 수 있음을 확인했다. 동시에, Bcl-xL의 과발현이 LC-3의 축적을 특성으로 하는 세포자가포식 또한 지연시킬 수 있음을 알았다. Flag으로 표지된 Bcl-xL를 이용한 면역침강법을 통하여, Bcl-xL이 카스파제 의존적인 세포자살의 중요한 매개체인 Bax, Bak과 상호작용하며, 동시에 세포자가포식의 중요한 매개체인 Beclin-1과도 상호작용한다는 사실을 밝혔다. 이러한 상호작용이 Bax, Bak, Beclin-1이 지닌 세포사멸(cell death) 유도 기능을 억제하는 것으로 예상했다. 결론적으로, Bcl-xL의 과발현은 재조합 CHO세포 배양에 있어서 세포자살과 세포자가포식을 동시에 막는다.
뷰티르산염(Sodium butyrate)을 첨가한 재조합CHO세포배양은 고농도의 단백질생산을 위해 가장 널리 쓰이는 방법 중 하나이다. 그러나, 뷰티르산염이 세포 성장과 세포자살 (apoptosis)에 미치는 부정적인 영향으로 인해 산업적 응용에는 제한성이 있는 것으로 알려져 있다. 뷰티르산염의 적용성을 향상하기 위해, 카스파제-3(caspase-3), 카스파제-7(caspase-7)과 같은 세포자살에 관여하는 매개체를 저해하는 시도가 있었지만 결과는 제한적인 성공이었다. 보다 효과적인 뷰티르산염에 의한 세포자살의 저해를 위해, 카스파제 -3과 카스파제-7을 활성화하는 것으로 알려진 카스파제-9(caspase-9)를 저해 하려는 시도가 요구되고 있다. 본 연구에서는 이를 위해 카스파제-3, 카스파제 -7, 카스파제-9의 저해제인 XIAP를 선정한 후 tet-off 시스템을 이용해 EPO를 생산하는 EPO-off-XIAP세포주를 확립하였다. XIAP 발현은 독시사이클린(doxycycline) 첨가에 의해 정확히 조절되며 EPO-off-XIAP세포주에서 과발현된 XIAP는 동시에 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-9의 활성을 저해할 수 있음을 확인했다. 그러나, XIAP 과발현은 뷰티르산염 농도에 상관없이 세포성장과 단백질 생산량에 영향을 주지 않았다. 또한, DNA 단편화 분석 (DNA fragmentation assay)도 XIAP과발현이 뷰티르산염에 의한 세포자살에 영향을 미치지 않음을 보였다. 결론적으로, 재조합CHO세포에서 XIAP의 과발현은 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-9의 활성을 저해할 수 있지만, 뷰티르산염에 의한 세포자살 저해 로는 이어지지 않는다는 사실을 확인하였다.
세포성장 촉진 자극하에서, Ras는 활성화되며 이는 세포성장과 세포보호에 관련된 세포 신호전달체계로 알려진 PI3K/Akt신호전달체계와 MAPK/ERK신호전달체계를 포함하는 다양한 세포신호전달체계의 활성화를 유도한다. 우선, 상시 활성화된 Ras(constitutively active Ras; CA-Ras)를 만드는데 있어 12번째 아미노산이 중요한 역할을 한다는 사실을 밝혔다. 상시 활성화된Ras의 과발현이 재조합 CHO세포의 성장에 미치는 영향성을 평가 하기 위해, EPO를 생산하는 재조합 CHO세포주에 tet-off시스템을 도입하여 EPO-off-CA-Ras세포주를 확립하였다. 비록 상시 활성화된Ras의 과발현은 비성장속도(specific growth rate; $\mu$)와 최대 세포수에는 의미있는 효과를 나타내지 않지만, 늦은 대수성장기에 생존 세포수를 증가시켰다. 배양 5일과 6일에, 상시 활성화된Ras가 과발현되는 조건 하의 생존세포수는 각각 (2.92±0.14)×$10^6$ cells/mL과 (3.02±0.09)×$10^6$ cells/mL이나, 상시발현 Ras가 과발현되지 않는 조건 하의 생존세포수는 (2.70±0.05)×$10^6$ cells/mL과 (2.80±0.07)×$10^6$ cells/mL이다. 예상과는 다르게, 상시 활성화된Ras의 과발현은 재조합CHO세포에서 MAPK/ERK 신호전달체계는 활성화하나 PI3K/Akt신호전달체계는 활성화하지 않는다. 결론적으로, 상시 활성화된Ras의 과발현은 재조합CHO세포에서 MAPK/ERK 신호전달체계의 활성화를 통해 늦은 대수성장기에 생존 세포수를 증가할 수 있다.
