Chinese Hamster Ovary cells have been used as the host cell line for the expression of many of the therapeutic proteins currently produced in mammalian cells. Process development has focused on aspects such as optimization of expression vector, medium formulation and bioreactor conditions and has successfully generated marketable quantities of proteins. However, the demand for therapeutics is ever-growing which necessitates a continuous research in this field to enhance protein production from mammalian cells.
This study primarily focuses on the protein factories of the cell, the Endoplasmic reticulum (ER). The ER is the first compartment in an ordered membranous network called the secretory pathway. This pathway is responsible for the synthesis, modification, and delivery of biologically active proteins to their proper target sites within the cell and the extracellular milieu. As with many other biochemical pathways, flux through the secretory pathway is controlled at its early steps. The ER is the entry site for the vast majority of proteins processed in the secretory pathway. Early steps in the maturation of secretory proteins take place in the ER, e.g., the folding of the nascent polypeptide chains and posttranslational modifications important for proper folding and function of the protein. Transit from the ER to the Golgi complex is the rate-limiting step in secretion for many glycoproteins. Hence cells have to be relieved of this post-translational bottleneck for a higher heterologous protein expression. Engineering of molecular chaperones is one such strategy. The effect of overexpressing Protein disulfide isomerase (PDI) on thrombopoietin (TPO) and antibody (Ab) is studied. It was found that the overexpression of PDI had no effect on the specific productivity of TPO producing cells whereas it had a moderately positive effect on the specific productivity of Ab-producing cell line.
Effect of overexpressing a molecular chaperone, PDI and its helper protein ERO1L is the focus of another chapter. It was seen that the co-overexpression enhanced the specific productivity of the Ab-producing cell line by about 62\% in transient conditions. However, there was no effect under stable expression of the genes. Further studies with regard to the optimum expression levels of PDI and ERO1L are needed to reconfirm these results.
Storing calcium in the ER is important in cellular signal transduction pathways, and which also may play a role in initiating apoptosis when ER stress is sustained. Although it is not entirely clear what causes the induction/execution of apoptosis, it is possible that by regulating the amount of calcium stored in the ER, and therefore the amount that can be released to the cytosol to trigger downstream events, one can affect apoptotic outcomes. Hence, to investigate the role of the glycoprotein-binding, $Ca^{2+}$ -binding chaperone, Calnexin (Cnx), in rCHO cells, a study was conducted. Cnx overexpression enhanced the specific productivity of the TNFR-Fc producing cells under sodium butyrate, NaBu, treatment but it also sensitized cells to apoptosis. Our findings suggest that changes in the expression of Cnx, via $Ca^{2+}$ homeostasis, may play an important role in the modulation of cell sensitivity to apoptosis induced by an external stimulus such as NaBu.
When protein folding in the ER is inhibited, signal transduction pathways, which increase the biosynthetic capacity and decrease the biosynthetic burden of the ER, to maintain the homeostasis of this organelle, are activated. These pathways are called the unfolded protein response (UPR).In this study, the pro-apoptotic component of the UPR, the GADD153 gene is silenced in an attempt to alleviate ER stress induced apoptosis. GADD153 silenced cells showed a better viability profile and lesser incidence of apoptosis under exclusive ER stress-inducing conditions of thapsigargin and Brefeldin A treatment. Under glutamine and glucose deprivation, also known to cause ER stress and hence the expression of GADD153, however, the GADD153 silenced cells had no obvious advantage over the control cells possibly because these are known energy providers for the cell and their deprivation can cause the induction of a variety of pathways of cell death and not just the ER stress-induced cell death.
재조합 CHO 세포는 현재 다수의 치료용 단백질 생산을 위한 동물 세포주 중 가장 널리 사용되는 숙주 세포이다. 공정 개발은 현재 발현 벡터 개발, 배지 조성, 세포 배양 조건의 최적화에 집중 되어있으며 이를 통해 상용화가 가능한 수준의 양을 생산할 수 있다. 그러나, 치료용 단백질 시장의 지속적인 성장에 의해 동물 세포주를 통한 단백질 생산성 향상이 요구되고 있다.
본 연구는 세포 소기관 중 단백질 생성의 주요한 역할을 하는 소포체와 이와 관련된 단백질 연구에 집중하였다. 소포체는 분비 경로(secretory pathway)라고 불리는 정렬된 막 네트워크의 시작점이다. 이 경로는 세포 내˙외부의 적절한 장소로 생물학적 활성을 지닌 단백질의 합성, 변형, 전달에 관여한다. 다수의 생화학적 경로처럼, 분비 경로의 흐름은 주로 초기 단계에서 조절된다. 소포체는 분비 경로에서 처리 되어지는 대부분 단백질이 들어가는 입구이다. 분비되는 단백질의 완성의 초기 단계는 소포체에서 일어난다. 예를 들면, 소포체는 초기의 폴리펩티드의 폴딩과 적절한 폴딩을 위한 전사 후 변형이 일어나는 장소이다. 다수의 당단백질의 분비에 있어서 소포체로부터 골지체로의 이동은 속도 결정 단계이다. 그러므로, 세포는 고농도의 외부 단백질 발현을 위해서는 전사 후 단계에서 일어나는 병목현상으로부터 자유로워져야 한다. 분자적 샤페론의 도입은 이런 목적을 위한 전략 중의 하나이다. 본 논문에서는PDI의 과발현이 TPO와 항체의 생산성에 미치는 영향을 연구하였다. PDI의 과발현은 TPO의 비생산성에는 영향을 미치지 못했으나 항체의 비생산성에는 긍정적인 효과를 보였다.
분자적 샤페론인 PDI와 PDI의 보조인자 단백질인 ERO1L의 과발현이 미치는 효과에 대한 연구는 두 번째 주제이다. 일시적 발현 상황하에서 두 단백질의 동시 발현은 비생산성을 62% 증가시켰다. 그러나, 안정적 발현 상황하에서는 아무런 효과를 나타내지 않았다. PDI와 ERO1L의 적절한 발현 정도에 대한 연구와 이에 대한 재검토가 필요하다.
소포체내의 칼슘 저장은 세포 신호전달체계에서 중요하며 소포체 스트레스시 세포예정사(apoptosis)의 시작에 있어서 중요한 역할을 한다. 세포사멸의 시작과 진행에 대한 원인은 완전히 밝혀지지 않았지만, 소포체 내부에 저장된 칼슘의 시토졸로 이동은 세포예정사를 발생시킬 가능성이 있다. 그래서, 당단백질 및 칼슘 결합 단백질의 Calnexin의 역할을 밝혀내는 연구를 수행하였다. Calnexin의 과발현은 뷰티르산염(sodium butyrate) 처리시 TNFR-Fc를 생산하는 재조합 CHO 세포주의 비생산성을 증가시켰지만, 세포사멸에 대한 민감성을 증가시켰다. 결론적으로, 칼슘의 향상성을 통한 Calnexin의 발현 변화는 뷰티르산염과 같은 외부 스트레스에 의한 세포예정사에 대한 세포의 민감성 변화에 중요한 역할을 할 것임을 알 수 있었다.
소포체내에서 단백질 폴딩이 제한될 때, 세포는 소포체의 향상성을 유지하기 위해 생화학적 합성을 증가시키고 소포체의 생화학적 축적물을 줄이는 신호전달체계를 활성화 시킨다. 이 신호전달체계를 unfolded protein response(UPR)이라 부른다. 본 연구에서는 소포체 스트레스에 의한 세포예정사를 막기 위한 시도로써 UPR의 세포예정사 유도 단백질인 GADD153를 저해하였다. Thapsigargin과 Brefeldin A가 처리됨으로 발생하는 소포체 스트레스 상황하에서 GADD153가 저해된 세포주는 세포 생존량의 향상과 세포예정사의 감소를 보였다. 하지만, 또 다른 소포체 스트레스로 알려진 글루타민과 글루코즈가 고갈된 상황하에서는, GADD153가 저해된 세포주는 긍정적인 효과를 보이지 않았다. 이러한 이유는 글루타민과 글루코즈는 세포에게 중요한 영양분으로써, 소포체 스트레스에 의한 세포사멸뿐만 아니라 다양한 세포사멸의 발생에 관여하고 있기 때문이다.
