Background
Caspases are cysteine proteases with essential functions in the apoptotic pathway; their proteolytic activity of various substrates is associated with cell morphological changes. Despite their importance in apoptosis, caspase regulatory mechanisms and substrates remain largely unknown. Some recent reports have revealed non-apoptotic functions for caspases, including autophagy. Therefore, I searched for modifiers of DCP-1 by screening enhancer and promoter element inserted Drosophila melanogaster lines (EP lines) for dominant suppressors of the Dcp-1 phenotype.
Results
I screened 15,000 EP lines for dominant modifiers of the GAL4-induced UAS-Dcp-1 eye phenotype and identified 72 Dcp-1 -interacting genes that were classified into ve groups based on their functions and pathways. Suppressors of the Dcp-1 overexpression phenotype consisted of nine autophagy-related genes. Generally, MAP kinase genes enhanced the Dcp-1 effect of this phenotype, and as predicted, many transcription factors also enhanced or were enhanced by DCP-1. Additionally, I identified several novel genes that interacted with Dcp-1. Expression of Atg8b-GFP, an indicator of autophagy, was detected in Dcp-1 eye imaginal discs and in the S2 cell line with full-length DCP-1 induction. Co-expression of DCP-1 and eGFP-Atg5 rescued the eye phenotype in adults and reduced cell death in larval eye imaginal discs. I analyzed the differences between full-length autophagy-inducing and truncated apoptosis-inducing DCP-1 using S2 cell cultures. I found the interrelation between caspase and autophagy-related genes by caspase activity test and expression level test. Also I found that the DCP-1 roles in Drosophila oogenesis. DCP-1 is necessary to induce autophagic cell death in oogenesis in starvation. After all, this phenomenon regulates fecundity against the starvation finally.
Conclusions
I identified several interesting Dcp-1 modifiers that reduced DCP-1-induced cell death. More importantly, these genes suggest the involvement of caspases in non-apoptotic functions. Our identification of Dcp-1 interacting autophagy-related genes could aid future investigations into relationships between apoptosis and autophagy as well as caspases and autophagy.
Background
Caspase는 외부로부터 apoptosis signal을 받아 세포 내의 다양한 하위 단백질을 분해하여 세포사멸을 일으키는 protease이다. 초파리 caspase DCP-1 은 포유류 caspase-3와 상동관계이고, caspase cascade의 최종단계에서 apoptosis 하위 신호전달을 시작하는 effector caspase로 알려져 있다. 최근의 연구결과들에 의해서는 Chromatin modifying enzyme PARP( poly (ADP ribose) polymerase), DNA repair proteins 그리고 autophagy와 같은 apoptosis와는 연관이 없는 단백질들에 대한 조절 기능이 점차 보고 되고 있다. 이러한 경향을 바탕으로 본 연구에서도 기존에 알려져 있던 apoptosis 신호와는 다른 caspase의 역할에 대하여 알아보고자 하였다. 그 첫 단계로 DCP-1이 눈에서 과발현 되는 형질전환 초파리 라인(GMR-DCP-1)을 만들었다. 이 형질전환 초파리의 표현형을 dominant하게 변화 시키는 유전자를 찾아내는 실험을 진행하였고, autophagy와의 연관성이 보고 되어 있는 Tor kinase, ATG1, EIP78, Bch등의 초파리 라인을 골라내었다. Autophagy는 apoptosis와는 달리 autophagosome vacuole 형성 과정을 거쳐서 세포 소기관과 long lived protein을 감싸고 이후 lysosome과 결합 autolysosome을 형성하여 세포 소 기관을 분해하는 현상을 말한다. Starvation등에 의해, Insulin/IGF class I PI3K의 하위 신호전달을 통해서 Autophagy를 억제 하고 있던 TOR(Target of Rapamycin)의 활성이 줄어들어, 유도된다고 알려져 있다. Autophagic cell death는 autophagy과정을 거쳐 최종적으로는 세포사멸을 일으키는 현상을 말하는데, autophagy 특이적인 double membrane vacuole이 발견된다.
Results
Autophagic cell death를 억제하는 것으로 알려진 Tor의 loss of function 돌연변이체와 autophagy gain of function을 일으키는 초파리 라인들을 GMR-DCP-1과 교배시킨 후손들에서는 GMR-DCP-1의 표현형이 상당 부분 정상적으로 회복되었다. DCP-1에 의한 caspase 활성이, autophagy 과발현이 유도된 초파리 라인과의 교배에 의해 줄어드는 양상을 보였다. autophagy를 억제한다고 알려져 있는 Tor등의 loss of function에 의해서 DCP-1의 caspase 활성이 줄어드는것을 확인할 수 있었다. 그리고, autophagy표시자인 ATG8b-GFP을 full-length DCP-1, trancated DCP-1과 각각 초파리 S2 세포주에서 발현시킨 후 autophagy를 관찰해 보았다. 그 결과 full-length DCP-1의 발현에 의해 autophagy가 유발되는것을 확인 할 수 있었고, 반대로 caspase의 활성형태인 truncated DCP-1은 빠르게 apoptosis를 유발하는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해서 DCP-1의 활성형태와 불활성형태에서의 기능의 차이를 확인할 수 있었다. DCP-1은 초파리의 암컷에서 oogenesis(난자 형성) 과정 중에 일종의 check point를 통해서 번식이 어려운 환경에서 비정상적으로 발달된 egg를 세포사멸을 통해서 제거하는 역할을 한다고 알려져 있다. 본 실험을 통해서 starvation에 의해 초파리의 난소(ovary)에서 autophagy가 증가되는 시기에 Dcp-1의 발현도 같이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. DCP-1 null인 난소에서는 starvation에 의해서도 autophagy가 발생되지 않는 것을 관찰하였다. 또한, DCP-1의 난소 특이적인 과발현에 의해서 정상적인 영양상태에서도 autophagy 현상이 발견되고, egg를 적게 낳게 되는 현상을 발견하였다. 이러한 실험들을 통해 DCP-1이 starvation 스트레스를 극복하기 위해 autophagic cell death를 유발하여, 최종적으로 각각의 개체가 낳게 되는 egg의 개수를 조절하여 전체적인 population을 조절하는 역할을 할 것이라는 결론을 내릴 수 있었다.
