Recent development and advance on nanotechnology has brought new insight into the area of biotechnology. Highly sensitive functional nano-probe system based on energy transfer was described here for detecting genetic abnormalities and physiological disease. In the present study, two kinds of functional nano-probe systems were demonstrated for the detection of cancer related biomarkers. In the first approach, a designated nanoprobe based on energy transfer between quantum dots (QDs) and AuNPs was demonstrated for detecting proteolytic activity. Assay of proteases relies on modulations in the PL intensity of the nanoprobes; protease activity causes the cleavage of the peptide substrate on the nanoprobes, resulting in the recovery of the PL intensity of the nanoprobes from the quenching state. Compared to the traditional Forster energy transfer-based assay, QDs (donors) and AuNPs (acceptors) can offer some advantages including multiplexed, longer distance flexibility. We investigated their typical property in terms of the quenching efficiency, sensitivity and selectivity on a chip surface for multiplexed format. In the second approach, conformational change-induced energy transfer system called ‘molecular beacon’ nano-probe was employed for use of mutation-targeted cancer diagnosis. This energy transfer based molecular beacon probe was designed for the epidermal growth factor receptor (EGFR) that provides important insights for new drug resistance monitoring. We developed simple approaches with real time PCR assay and in situ single cell imaging technology as a tool for EGFR mutation screening by using designed molecular beacon probe. The ability of molecular beacon probes to detect specific target molecule without separation of unbound probes was able to provide a sensitive and selective assay in clinical applications. From these results, it is anticipated that the developed system will find various applications especially in clinical diagnosis.
생명과학의 발전과 더불어 형광현상을 이용한 연구 방법들이 더욱 다양하게 소개되고 있다. 이들 중 하나인 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 은 두 개의 서로 다른 파장영역의 형광물질이 인접하였을 경우 하나 (Donor)의 형광을 일으킬 수 있는 에너지가 다른 형광물질 (Acceptor)에 전달되어 다른 형광을 나타내는 현상을 이용한 것이다. 이는 거리에 의존하기 때문에 두 물질에 우리가 감지하고자 하는 생체분자와 접목하여 표적 분자 사이의 반응성을 고감도, 실시간으로 분석할 수 있어 다양한 생물학적 응용의 가능성이 크다.
따라서 본 연구에서는 나노기술의 발전과 접목하여 에너지 전이 현상을 이용하여 생체 질병의 마커 단백질의 변이나 활성을 측정할 수 있는 나노 탐침(Nano-probe)을 개발, 적용하였다. 먼저, 칩 표면에서 나노입자간의 에너지 전이현상을 이용하는 나노 탐침을 개발함으로써, 질병 특이적 마커로 사용되는 단백질 효소의 활성을 효과적으로 측정하는 방법을 소개하였다. 에너지 공여자로서 양자점(quantum dot)을, 에너지 수여자로서 금 나노입자(gold nanoparticle)를 사용하여 다양한 프로티아제의 활성을 동시에 분석하였다. 이는 기존 형광공명에너지 전달(FRET) 시스템과 비교하여 볼 때, 양자점 나노입자의 높은 양자효율(quantum yield)과 금 나노 입자(gold nanoparticle)의 파장에 관계없이 넓은 파장의 에너지를 흡수하여 형광을 억제(quenching) 시키는 광학적 성질로, 10 nm 이상의 거리에서도 측정이 가능하였고 측정감도가 향상되었다. 또한, 칩 표면에서의 소량의 단백질 시료만이 사용되며 고정화되어 여러 반응을 수행 시, 외부 환경에 민감한 나노입자의 응집(aggregation)이 없고 다른 buffer 조건에서도 영향 받지 않는 장점이 있다. 둘째는 헤어핀 형의 이차 구조를 가진 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)의 분자 비콘 (Molecular beacon) 탐침에서의 양 말단의 형광물질의 에너지 전이를 이용하여 질병 특이적 염기서열의 변형을 측정하였다. 이를 위해 폐암 환자의 약물 투여 및 내성에 영향을 미치는 세포 성장 리셉터 (EGFR)의 염기 서열의 변형(point mutation)을 표적으로 하는 분자 비콘을 디자인 하였다. 환자의 genomic DNA를 이용하여 real time PCR 에서의 증폭과 동시에 검출하는 방법을 이용하여, 기존의 염기서열을 분석하는 방법(direct sequencing)과 비교하여 고감도로 빠르게 분석하였다. 표적 염기서열의 존재시에만 특이적으로 두 형광 물질 사이의 에너지 전이 상태가 변하는 구조적 특징을 이용하여, 암세포 내의 mRNA 를 바로 분석하였다. 개발된 분자비콘을 고정된 암세포에 직접 반응시킴으로써 단일 세포 수준에서도 염기서열의 변형을 쉽고, 빠르게 분석이 가능하였다. 본 연구에서 소개된 에너지 전이 현상을 이용한 나노 탐침의 개발과 질병 특이적 마커 단백질인 가수분해 효소의 활성 분석과 단백질 염기서열의 변형 분석으로의 응용은, 진단 및 신약개발 시 소요되는 비용의 절감과 고감도 대량검색의 장점을 제공해 줄 수 있기 때문에 질병의 조기 진단, 유전체 및 단백체 연구와 신약 개발 등에 있어 큰 의미를 갖고 있다.
