For the efficient and specific delivery of siRNA, protein-based vehicles were produced and characterized. A double-stranded RNA binding domain (dsRBD) of human dsRNA activated protein kinase R (PKR) was utilized to complex small interfering RNA (siRNA) to deliver into mammalian cells. The recombinantly produced polypeptide dsRBD exhibited its native binding activity for siRNA without sequence specificity and the complex protected siRNA from its degradation by ribonuclease. The resultant siRNA/dsRBD complexes were transfected to mammalian cells for target gene inhibition. GFP fluorescence inhibition assay showed prominent down-regulation of a target gene when the endosomal escape function was supplemented by addition of fusogenic peptide, KALA. These results suggest that dsRBD based carrier could be successfully applied for a wide range of therapeutic siRNAs for intracellular gene inhibition, without showing any cytotoxicity.
To accomplish multi-functionality such as binding affinity to siRNA, specific cell recognition and efficient endosome escape with a single molecule of protein vehicle, a multi-domain siRNA delivery carrier was constructed by using streptavidin and Pseudomonas Exotoxin A (ETA) fusion protein with cell membrane binding moiety. The resultant protein carrier showed binding affinity for various biotinylated molecules such as fluorescein (FITC), siRNA and biotinylated poly (ethylene glycol) (PEG) grafted poly ($_L$-lysine) (PLL). When the epidermal growth factor (EGF) receptor ligand was engineered to the protein carrier construct, efficient intracellular delivery of biotinylated FITC into EGF receptor overexpressing cell was observed by confocal microscopy. For GFP fluorescence inhibition assay, cell penetrating peptide, HPH, was introduced to N terminal region of ETA-STR protein construct. The evident down-regulation of GFP expression was shown with cell line dependency when transfected with complexes of the multidomain protein based siRNA delivery carrier, HPH-ETA-STR, and GFP siRNA. The variability of biotinylated molecules could permit versatile use of those carrier, as indicated by complexation experiment with nucleic acid-condensing cationic polymer, biotin-PEG-g-PLL.
In conclusion, we synthesized novel protein-based siRNA delivery carrier. Diversity of natural and artificial protein domain function and flexibility of protein engineering allow this category of non-viral vehicles to be promising therapeutic and research tools for such as treatment of cancer and genetic disorder.
최근 인체 내로 다양한 siRNA를 전달함으로써 원하는 유전자를 선택적으로 억제하기 위한 다양한 방법들이 개발되고 있다. 본 실험에서는 인체에서 발현되는 단백질로써 이중선 RNA에 결합하는 것으로 알려진 단백질 인산화 효소인 PKR을 사용하여 siRNA 전달체를 개발하였다. 단백질의 효소활성을 갖는 도메인을 제외한 재조합 단백질인 이중선 RNA 결합도메인(dsRBD)를 대장균을 이용해서 생산하였다. dsRBD는 원래의 RNA에 대한 결합 능력을 유지하고 있었으며 RNA 제한효소에 의한 분해에서 siRNA를 보호하는 효과를 보여주었다. 특정 유전자의 발현을 억제하기 위해 siRNA/dsRBD 복합체를 인간 세포에 전달하는 실험에서, 이 복합체는 녹색형광단백질의 발현을 감소시키는 결과를 보여주었다. 이 실험에서는 dsRBD가 갖추지 못한 엔도솜 이탈 능력을 보완하기 위하여 융해 펩티드인 KALA를 첨가하였다. 이 새로운 단백질 전달체는 사용 범위 내에서 세포독성이 없는 것으로 확인 되었다. 이러한 결과는 dsRBD를 이용한 전달체가 다양한 siRNA를 세포에 전달하여 목적하는 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 의미한다.
siRNA 전달체가 효과적으로 사용되기 위해서는 siRNA에 대한 결합 능력, 원하는 특정 세포에 결합하는 능력, 그리고 엔도솜 이탈 능력 등 다양한 기능을 동시에 수행하여야 한다. 이러한 복합적인 기능을 하나의 단백질 전달체로 수행하기 위해서는 각각의 기능을 갖는 복합도메인 단백질을 만들어야 한다. 이 연구에서는 biotin에 대한 결합 기능을 갖고 있는 streptavidin과 Pseudomonas Aeruginosa의 외독소(ETA)에서 분리한 엔도솜 이탈 기능을 갖는 도메인, 그리고 세포 표면에 결합할 수 있는 펩티드를 이용하여 이러한 복합도메인 단백질을 제조하였다. 그 결과 만들어진 단백질 전달체는 biotin화 되어 있는 FITC, siRNA, 그리고 PEG가 공중합된 PLL 중합체에 대한 결합 능력을 보여주었다. 복합도메인 단백질에 상피세포성장인자 수용체에 결합할 수 있는 리간드 도메인을 재조합한 단백질 전달체는 이 수용체를 과발현하는 세포에 효과적으로 biotin이 연결된 FITC를 전달하는 것이 공초점 형광현미경을 통해 확인되었다. 녹색형광단백질을 억제하는 실험에서는, ETA와 streptavidin 도메인에 세포투과성 펩티드인 HPH를 재조합한 새로운 전달체를 사용하였다. 만들어진 복합도메인 단백질과 biotin화 된 녹색형광단백질 siRNA의 복합체를 세포로 전달한 결과 세포주에 따라 뚜렷하게 녹색형광단백질의 발현을 저해하는 것이 확인되었다. Biotin은 다양한 분자에 연결할 수 있어 이 전달체를 이용하면 폭넓은 범위의 목적과 용도를 갖는 분자들을 세포 내로 전달할 수 있을 것으로 예상된다.
자연계에 존재하거나 인공적으로 만들어낸 단백질 도메인들의 기능의 다양성과 단백질 재조합 기술의 유연성을 고려할 때 이러한 범주의 전달체들이 앞으로 암이나 유전질환의 치료와 연구 목적으로 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대한다.
