Aptamer, in vitro selected functional oligonucleotides, has been applied various biosensors due to its inherent selectivity, affinity, and diverse advantages. Many biosensors based on aptamer used electrochemical biomarker to detect biomolecules and signal amplification. [1] Signal amplification is one of the most important strategies in lowering detection limit of biosensors. Enzyme labels have been widely used because they can generate many electroactive signal reporting molecules. [2]
Here we report a signal amplified electrochemical aptasensor using competitive between aptamer-complementary DNA couple and aptamer-target biomolecule couple. The gold electrode was modified with self-assembled monolayers of aptamers. Continually the aptamers make DNA double helix with biotinylated complementary s. In the absent of target biomolecules, strepavidin-conjugated alkaline phosphatase(ALP) can bind to the biotin. But in the presence, the target biomolecules replace the complementary DNA sequence so that the strepavidin-conjugated ALP can’t bind. It needs that the binding affinity between aptamer and target biomolecule is much higher than that of aptamer-complementary DNA couple, and we can make this circumstance by reducing the number of complementary binding base pairs of double helix. The competition results in a decrease of the enzyme product which can be detectable by electrochemical methods.
우리는 이번 연구에서 아데노신(adenosine)과 앱타머(aptamer)간의 결합과 DNA와 앱타머 간의 상보적 결합 사이의 경쟁관계를 이용하여 아데노신(adenosine)을 검출하는 새로운 전기화학적 방법을 개발하였다.
우선, 아데노신 바인딩 앱타머와 그에 상보적인 DNA로 이루어진 이중나선의 안정성을 확인하기 위해 자외선-가시광선 분광기 (UV-VIS spectrometer)로 이중나선의 녹는점을 측정한 후, 아데노신-앱타머 간의 결합과 DNA-앱타머 간의 상보적 결합이 동시에 안정한 최적점을 찾았다. 그리고 아데노신의 앱타머에 대한 경쟁적 결합을 산화 환원 측정 순환 전압전류 법(CV)을 이용하여 두 가지 방법으로 측정하였다. 우선, alkaline phosphatase(ALP)에 의해 α-naphtyl phosphate(α-NP)이 분해되어 전기화학적으로 활성을 띠는 물질이 얼마나 생성되는지 측정하였다. 두 번째로, ferricyanide의 음전하와 DNA의 음전하가 전기적으로 반발하는 양을 측정하여 센서 피막의 생성을 확인하고 그 효과를 검증하였다.
산화 환원 측정 순환 전압전류 법 결과에 의하여 아데노신과 앱타머간의 특이적 반응이 확인되었으나, 센서 시스템에서 Avidin-alkaline phosphatase (Av-ALP)가 비특이적으로 DNA나 MCH표면에 붙어서 신호를 내는 것은 아닌지 biotin이 붙지 않은 아데노신 결합 앱타머를 사용하여 검증하였다. 컨트롤 실험을 통하여 이 센서 시스템이 아데노신과 같은 뉴클레오시드(nucleoside) 족인 사이티딘(cytidine)을 구분하기에 충분하다는 것을 확인하였다. 이에 더해 정량실험도 하였다. 본 연구에서는 다른 농도의 아데노신으로 전류의 변화를 측정한 결과 10μM까지 아데노신의 농도를 측정할 수 있었다. 특히 본 실험에서 아데노신이 들어가지 않은 경우에 최고 전류가 25μA까지 발생되었는데 이는 기존에 알려진 아데노신을 이용한 센서시스템에서 보고되는 전류의 12배 이상이다.
본 연구의 새로운 방법은 측정 표면을 제작하기가 용이하면서도, ALP를 표지로 하여 앱타머가 작은 분자를 검출하는데 유용하게 사용될 것이다. 또한 절대적인 전류가 크게 증폭되는 방법으로서 앱타머를 이용한 아데노신 검출뿐 아니라 작은 분자 검출에도 유용하게 적용 될 것이다.
