Glyoxal(GO) is an aldehyde compound that is toxic and mutagenic. Glyoxal-resistant mutants were isolated from Escherichia coli MG1655 strain lacking yqhD gene, encoding an aldehyde reductase for glyoxal, on LB plates containing 5-10 mM glyoxal. By isolating nearby TnphoA-132 insertions the glyoxal-resistant mutants, the mutaion sites were mapped and analysed.
One of them was NemA over-expressing strain, which has a single nucleotide change in NemR-binding seqeunce upstream of nemRA operon. N-ethylmaleimide reductase encoded by NemA is a enzyme that reduces N-ethylmaleimide. nemA and nemR constitute an operon, in which NemR serves as a negative regulator for its transcription. A mutaion in NemR- binding site is expected to prevent binding of NemR, overproducing both NemR and NemA.
GloA encoding glyoxalase I for catalyzing methyl-glyoxal (MG) is located downstream of the nemRA operon, whose transcription was increased in NemR-binding site mutation. Thus, it is proposed that over-expressing of both NemA and GloA is required for GO resistance confered by the NemR-binding site mutation.
Glyoxal은 반응성이 큰 aldehyde 화합물로써 생체내에서 glucose등 당과 단백질간의 반응, 지질의 과산화, 자외선, 산화적 스트레스등에 의해 생성되어 DNA 와 단백질과 반응 하여 돌연변이를 일으키거나 효소 작용을 저해하여 세포독성을 보이며, AKR, AldA, GldA, GloA/B 등에 의해 환원되어 무해하게 변환된다. 이러한 glyoxal의 내성에 관련된 단백질 중 YqhD는 aldehyde reductase로써 transcription factor인 YqhC에 의해 발현이 조절되어 YqhC 돌연변이체 중 YqhD가 계속적으로 발현되어 glyoxal에 내성을 보이는 균주도 있다. 우리는 yqhD를 제외한 새로운 glyoxal 내성 관련 유전자를 screening하기 위하여 yqhD 유전자를 Tn10 transposon으로 제거한 균주를 glyoxal이 포함된 LB plate에 도말하여 생존한 돌연변이 콜로니들을 분리하여 분석하였다. 그 중 glyoxal에 내성을 보이는 균주 16개를 골라내어 TnphoA-132 transposon hopping을 통해 linkage analysis를 실시하여 돌연변이의 위치를 탐색하였다. 그 결과 13개의 돌연변이가 공통적으로 rsx 오페론의 부근에 위치한 것으로 나타났다. rsx 유전자 발현물은 산화적 방어 기작의 sensor 및 activator역할을 하는 SoxR의 reducer 역할을 하므로 rsx 유전자들 중의 돌연변이가 glyoxal 내성에 관련될 가능성이 충분하다. 또한 다른 glyoxal 내성 돌연변이 중 SodB 및 NemA 과발현 균주도 확인되었다. SodB는 iron-dependent superoxide dismutase로서 과발현시 산화적 스트레스에 내성을 보일 가능성이 충분하다. NemA는 N-ethylmaleimide (NEM) reductase로서 같은 오페론에 속한 NemR에 의해 발현을 억제 받는다 NemR은 nemR 의 promoter에 위치한 NemR box에 결합 함으로써 nemRA 오페론의 발현을 억제하는데 NemA 과발현 균주 (JC-15)의 경우 이 NemR box의 일치 서열 중 G가 A로 변환되어 NemR의 결합 친화력이 떨어져 nemRA 오페론의 발현이 증가한다. 또한 nemRA 오페론의 유전자 하류에 위치한 gloA의 mRNA 발현도 증가하는 것으로 보아 JC-15 균주의 glyoxal에 대한 내성은 NemA 및 GloA가 동시에 작용하는 것으로 판단된다.
