It has long been axiomatic that the function of a protein is directly related to its three-dimensional structure. Recently, however, the observation that numerous functional proteins lack intrinsic globular structure or contain long disordered segments under physiological conditions shifted the classical protein-structure paradigm to an alternative one such as ‘the protein trinity’ or ‘the protein quartet’ model. During last 10 years, there is a growing interest in this protein class, so called ‘the intrinsically unstructured proteins (IUPs)’. The IUPs play critical roles in the important cellular processes including cell signaling and regulation. Here we report structural study on the IUPs by using NMR spectroscopy.
The Arabidopsis HY5 protein is a basic leucine zipper (bZIP) transcription factor that promotes photomorphogenesis. HY5 binds directly to the promoters of light responsible element containing the G-box and thus regulates their transcriptional activity. The level and activity of HY5 are negatively regulated, in a light-dependent manner, by interaction with the COP1 protein, which targets HY5 for proteasome-mediated degradation in the nucleus. Despite its essential roles in plant development, no structural information exists for HY5. Here, we report the first structural and biophysical characterization of HY5. Using limited proteolysis in combination with mass spectrometry, circular dichroism and nuclear magnetic resonance spectroscopy, we have deduced that the N-terminal 77 amino acids of HY5 form a premolten globular structure, while amino acids 78-110, which constitute the basic region (BR) of the protein, exist in a molten globule state. Our studies also revealed that the overall structural features of full-length HY5 are dominated largely by the disordered N-terminal domain, despite the existence of a bZIP domain at its C-terminus. We propose that HY5 is a member of the intrinsically unstructured protein (IUP) family, and that HY5 functions as unstructured and benefits from being an unstructured protein in vivo.
Contrary to the classical protein structure-function relationship, there are increasing numbers of proteins that are intrinsically unstructured and functional. Some of the unstructured proteins are structurally distinguished from complete random coils such that they do retain a residual structure. The p21 protein is now known as a multifunctional protein that is involved not only in cell cycle control but also in apoptosis, transcription, differentiation, etc. It has been reported that the p21 (145-164) is unstructured under physiological conditions and adopts multiple conformations upon binding to its targets. However, how these structural characteristics of p21 (145-164) are associated with its diverse functions is poorly understood. Here, we report structural ensemble of the residual structure of p21 (145-164) by combining NMR measurements with molecular dynamic simulation. We found that the N-terminal segment of the p21 peptide encompassing S146-Y151 has a helical propensity and the C-terminal region of the peptide encompassing L157-K163 has a tendency for a loop-like region that further becomes an extended conformation upon binding to PCNA, whereas the region in-between can adopt either conformation. Interestingly, this secondary structural preference of free p21 peptide is consistent with its bound conformation to CaM and PCNA. This suggests that the final bound conformation of p21 (145-164) is inherent to the peptide even without binding to a target. Based on the comparison of RDC-based homology model of CaM/p21 (145-164) with crystal structure of PCNA/p21 (139-160), we suggest that different major driving force of a p21 target to stabilize residual structure of p21 (145-164) contributes to determine the bound conformation of p21 peptide. Our study provide structural insight into how multiple conformations of the p21 (145-164) are related to its binding diversity and specificity in its molecular recognition.
애기장대 HY5 단백질은 photomorphogenesis 현상을 촉진시키는 bZIP 전사인자이다. HY5는 G-box를 포함하는 빛 반응 요소의 촉진자에 직접 결합하여 전사 활성을 조절하는 역할을 한다. HY5의 활성과 양은 빛에 의존하여 조절되는데, 이것은 HY5를 분해시키는 COP1 단백질과의 상호작용으로 이루어진다. HY5가 식물발달에서의 필수적 역할을 함에도 불구하고 이에 관한 구조적 정보는 아직까지 밝혀지지 않았다. 이에, 여기서 HY5의 첫번째 구조적, 생물리학적 연구를 보고한다. 질량분석과 제한적 단백질분해, 원평광 이색성 분광편광계, 핵자기 공명법을 이용하여 HY5의 아미노 말단 77개의 아미노산이 구조가 없다는 것을 밝혔다. 이에 HY5는 내재적 무정형 단백질의 한 구성원이며 실제 생체 내에서 무정형 단백질로서 이점을 취하며 기능을 할 것이라 제안한다.
기존의 고전적인 단백질-기능 관계와는 달리 구조가 없으나 기능을 하는 단백질의 수가 점차적으로 많이 보고되고 있다. 이러한 무정형 단백질은 모두가 전혀 구조가 없는 것이 아니라 어떤 것은 잔여 구조를 가지고 있다. p21은 이제 세포 주기를 조절하는 것뿐 아니라 세포 사멸, 전사, 분해 등 여러 가지 역할을 하는 단백질로 알려져 있다. p21 (145-164)은 생리적 조건 하에서 구조가 없고 다른 목적 단백질에 결합하여 다른 구조를 취한다는 것이 보고되었다. 그러나 이 펩타이드의 이러한 구조적 성질이 그 다양한 기능과 어떻게 관여되는지에 관해서는 알려진 바가 없었다. 이에 여기서는 핵자기 공명 분광법과 분자 동력학적 모사를 합하여 p21 (145-164)의 잔여 구조의 구조 앙상블을 보고한다. p21 (145-164)의 아미노 말단은 알파-나선 구조, 카복실 말단은 베타-병풍 구조에 관한 경향성을 가지고 있고 그 중간은 두 구조 모두에 관한 경향성을 가지고 있다. 흥미롭게도, 이러한 p21 (145-164)의 단독 구조의 2차 구조 경향성은 그것이 목적 단백질과 결합한 2차 구조와 일치한다는 사실을 발견하였다. 이것은 p21 (145-164)의 결합 구조가 목적 단백질과 결합하기 전부터 이미 가지고 있는 성질이라는 것을 의미한다. PCNA와 결합한 p21 (139-160) 결정구조와 RDC에 근거한 CaM과 결합한 p21 (145-164) 모델 구조를 비교함으로써, p21 (145-164)의 최종 결합 구조는 p21 (145-164) 펩타이드 뿐 아니라 그 목적 단백질이 p21 (145-164)를 안정화시키는 주요한 힘에 의해 결정될 것이라 제안한다. 본 연구는 다양한 구조를 갖는 p21 (145-164)이 실제 분자 인식에서 어떻게 상대 단백질에 결합 특이성과 다양성을 부여하여 어떻게 기능을 하는지에 관한 구조적 통찰력을 제공해 주고 있다.
