Vaccine is a cost-effective and prophylactic tool to defend host from infectious diseases. There are mainly three types of vaccines, inactivated whole cells, live attenuated whole cells, and purified or recombinant microbial components. Of these, inactivated whole cell vaccines are widely used due to convenience and low cost for preparation with high immunogenecity. Specific aims of in this work are (1) to characterize unique immunological properties to killed-whole cell cholera vaccines as a model system, (2) to develop a reliable serologic assay to evaluate vaccine efficacy for use in clinical trials, (3) to examine pokeweed mitogen (PWM) which has been used as a laboratory reagent in the evaluation of lymphocytes of vaccinees because of its human T or B-cell mitogenic potential. First, cholera vaccine showed different Toll-like receptor (TLR) response, TLR2 was a major receptor for killed V. cholerae rather than TLR4 unlike other gram-negative bacteria in chinese hamster ovary cell (CHO) system and human monocyte. Moreover, we demonstrated that LPS is not the major immuno-stimulating cell-wall component since the LPS purified from V. cholerae is less potent to induce inflammatory cytokines than membrane proteins or heat killed V. cholerae (HKVC). Secondly, we developed an improved assay for reliable serological assay of cholera vaccine. Through testing 30 pairs of clinical samples, we compared microtiter-plate format, which is normally used in clinical trials, to semi-automated assay a newly developed method in terms of correlations of the vibriocidal titers and fold increases in titers between pre- and post-vaccinated sera., Notably, the newly developed semi-automated assay demonstrated that serum samples with the same endpoint titers turned out to have distinct vibriocidal kinetics which were not distinguishable by the microtiter-plate assay. The semi-automated assay provides better sensitivity, accuracy, and stability of the assay results with minimized efforts than conventional microtiter-plate assay, and the newly developed method could provide a useful tool as an in vitro surrogate assay for the evaluation of cholera vaccine efficacy. Finally, we investigated immunological properties of commercially available PWM. We found that polymyxin B (PMB), a specific inhibitor of endotoxin activity, inhibited PWM-induced expression of proinflammatory cytokines and NO and the activation of Toll-like receptor 4 (TLR4). A kinetic-turbidimetric Limulus amebocytelysate assay demonstrated that commercial PWM contained substantial endotoxin, over $10^4$ endotoxin units/mg of the PWM. PWM repurified by PMB-coupled beads does not induce the expression of proinflammatory cytokines, TLR4 activation, or dendritic cell maturation any more, but induces proliferation of human lymphocytes, which is a representative characteristic of PWM. These results suggest that commercial PWM might be contaminated with a large amount of endotoxin, resulting in the attribution of misleading immunological properties to PWM.
백신은 감염성 질병으로부터 숙주를 방어하는데 있어 가장 비용적으로 효과적인 예방도구이다. 현재 상용적으로는 사균 전체백신, 생 돌연변이 백신, 분리·재조합 미생물 구성분으로 만든 백신들이 존재한다. 이 들중에 사균 전체백신은 높은 면역성을 가지면서 편리성과 낮은 제조비용 때문에 널리 사용되고 있다. 이 연구의 구체적 목적은 (가) 모델 시스템으로써 콜레라 사균백신에 대한 독특한 면역학적인 특성을 살피고, (나) 임상시험에서 사용하기 위한 백신 효능평가를 위한 신뢰할 수 있는 혈청학적인 분석법을 개발하며, (다) 인체 T- 혹은 B-림프구의 분열을 유도할 수 있는 특성때문에 세포매개에 의한 백신 효능 평가에서 널리 이용되고 있는 pokeweed mitogen (PWM)의 특성을 알아보고자 한다. 첫째, 콜레라 백신은 chineses hamster ovary cell (CHO)와 인체 monocyte에서 다른 그람 음성세균에 의해 보여지는 특성과 다른 toll-like receptor (TLR) 반응을 보였다. 즉, TLR4가 아닌, TLR2가 사균 콜레라에 대한 주 수용체였다. 더욱이, 콜레라에서 분리한 지질 다당류(LPS)가 열에의해 죽은 콜레라(HKVC)나 막 단백질들보다 훨씬 면역 염증반응을 일으키는데 약한 것으로 보아 면역반응을 유도하는 주 세포벽 성분이 아니라는 것을 증명하였다. 두번째, 콜레라 백신의 개선된 혈청학적 분석방법을 개발하였다. 총 30명의 임상 샘플을 현재 임상시험에서 이용되고 있는 microtiter-plate 방법과 이 연구에서 개발한 반 자동 분석방법을 이용하여 콜레라를 죽일수 있는 역가와 백신접종의 전·후 샘플의 역가 증가량 측면에서 비교 분석하였다. 특히, 새로이 개발된 반자동 분석법은 microtiter-plate 방법에서는 구분이 되지 않았던 다른 동역학적인 역가의 특성을 갖는 샘플의 차이를 보일 수 있었다. 또한, 이 방법은 적은 노력으로 기존의 microtiter-plate분석방법보다 더 좋은 민감성, 정확성, 안정성을 제공하고 콜레라 백신 효능평가에 유용하게 이용될 수 있다. 마지막으로, 상업적으로 이용이 가능한 PWM의 면역학적인 특성을 조사하였다. 균체내 독소 (endotoxin)에 특이적인 저해제인 polymyxin B (PMB)는 PWM에 의해 유도되는 염증 유발 싸이토카인의 발현, NO, TLR4의 활성화를 방해함을 보여주었다. 또한, 상업적인 PWM 1mg내에는 $10^4$ 이상의 endotoxin unit이 함유되어있음을 증명하였다. PMB가 붙은 구슬을 이용하여 균체내 독소를 제거한 PWM은 염증 유발 싸이토카인의 발현, TLR4의 활성화, 수지상 세포의 성숙분열을 유도하지 못하였지만 PWM의 대표적인 특성인 인체 림프구의 분열유도는 할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합 해 볼때, 상업적으로 이용이 가능한 PWM은 상당량의 균체내 독소로 오염되어있을 수 있고 이로 인해 PWM에 대하 면역학적인 특성들이 오인되어질 수 있다.
