Here I show that RASSF1A serine 203 can be phosphorylated by Aurora kinases at spindle poles and spindles during mitosis, while the same residue is phosphorylated by cyclin D-Cdk4 in the nucleus during interphase. Theses data suggest that the RASSF1A phosphorylation by different kinases regulates the cell cycle in the specialized cellular compartments. Indeed, Aurora A-mediated RASSF1A phoshphorylation activates the mitotic ubiquitin ligase APC by inducing its dissociation from an APC activator Cdc20 during prometaphase. Paradoxically, RASSF1A itself can be also degraded by cyclin D-Cdk4-mediated phosphorylation followed by another ubiqutin ligase SCF-Skp2-dependent ubiquitination at the $G_1$-S transition. Since Human cancers often show overexpression of Aurora kinases, Skp2, cyclin D1 and high levels of Cdk4 activity, the diminishing RASSF1A activity by Aurora kinases, Skp2 or cyclin D-Cdk4 may contribute to tumorigenesis. Therefore, I had to divide this thesis into the Aurora kinases-RASSF1A story (PartI) and the SCF-Skp2-RASSF1A story (PartII).
PART Ⅰ Abstract
The Aurora (Ipl) family kinases play important role in regulation of mitosis in eukaryotes(Marumoto et al., 2005; Nigg, 2001). The tumor suppressor RASSF1A regulates mitotic progression by inhibiting anaphase-promoting complex (APC)-Cdc20 activity(Agathanggelou et al., 2005; Jackson, 2004; Song et al., 2004; Yu, 2007), but the regulation of this action has remained unknown. Here, we show that Aurora kinases associate with and phosphorylate RASSF1A on serine 203 in vivo during mitosis. Notably, both depletion of Aurora A by RNA interference (RNAi) and expression of the nonphosphorylatable S203A mutant of RASSF1A, which did not contribute to the spindle checkpoint activation, led to a marked delay in prometaphase progression beyond mitotic entry. This is likely due to the failure of dissociation of RASSF1A from Cdc20, the constitutive inhibition of APC-Cdc20 and the persistent accumulation of mitotic cyclins. By contrast, the phosphomimic S203D mutant had reduced ability to bind to Cdc20 and inhibit APC-Cdc20 activity, thereby leading to normal mitotic progression and the delay in prometaphase progression beyond mitotic entry in Aurora A-depleted cells was correctly restored by expression of the phosphomimic S203D mutant of RASSF1A. Moreover, we found that phosphorylation of RASSF1A by Aurora B during late mitosis is required for the interaction of RASSF1A with Syntaxin16, a member of the t-SNARE family(Glotzer, 2005; Straight and Field, 2000), and for the proper recruitment of Syntaxin16 to the spindle midzone and the midbody for successful completion of cytokinesis. The deregulation of Syntaxin16 apparent in cells depleted of Aurora B were normalized by expression of the S203D mutant of RASSF1A. These findings implicate Aurora kinases-mediated phosphorylation of RASSF1A in regulation of both the timing of mitotic progression and cytokinesis.
PART Ⅱ Abstarct
The tumor suppressor RASSF1A is inactivated in many human cancers and is implicated in regulation of microtubule stability, cell cycle progression, and apoptosis. However, the precise mechanisms of RASSF1A action and their regulation remain unclear. Here we show that Skp2, an oncogenic subunit of the SCF ubiquitin ligase complex, interacts with, ubiquitinates, and promotes the degradation of RASSF1A at the $G_1$-S transition of the cell cycle. This Skp2-dependent destruction of RASSF1A requires phosphorylation of the latter on serine 203 by cyclin D_Cdk4. Interestingly, mutation of RASSF1A-phosphorylation site $Ser^{203}$ to alanine results in a delay in cell cycle progression from $G_1$ to S phase. Moreover, enforced expression of Skp2 abolishes the inhibitory effect of RASSF1A on cell proliferation. Finally, the delay in $G_1$-S progression after Skp2 removal is normalized by depletion of RASSF1A. These findings suggest that the Skp2-mediated degradation of RASSF1A plays an important role in cell proliferation and survival.
세포 주기는 각 단계에서 특이적인 조절인자들의 인산화와 유비퀴틴화에 의하여 조절된다. 비정상적인 세포 주기 조절의 경우 유전체 불안정성이 유도되며, 연속된 유전체 불안정성의 축적으로 암이 유발된다. 항암 유전자 RASSF1A는 많은 암종에서 비활성화 되어 있으며, RASSF1A의 유전자 적중 마우스는 자연발생적으로 종양을 형성한다고 보고되었다. 또한, RASSF1A는 세포 주기 조절인자를 통제하거나 세포내 미소관 (microtubule)의 안정성을 증가시킴으로써 세포 주기를 조절하는데 기능한다고 보고되고 있다. 최근에는 RASSF1A가 중요한 세포 분열 조절자인 APC/C 복합체의 활성인자인 Cdc20와 결합함으로써 APC-Cdc20의 활성을 저해하여 세포 분열 진행 시기를 조절한다고 보고되었다. 본 연구에서는 세포 주기의 진행 과정에서 항암 단백질 RASSF1A가 발암 단백질로 알려진 세포 주기 조절 인자들인 Aurora 인산화효소나 Skp2와 상호 작용함으로써 세포 주기 조절에 기여함을 밝혔다.
발암 단백질 Aurora 인산화효소는 많은 암종에서 그 유전자가 증폭되거나 단백질이 과발현 되어있으며 현재 Aurora 인산하효소의 억제제는 항암 치료제로 임상에의 도입이 시도되고 있다. Aurora 인산화효소는 세포 분열시기에 특이적으로 활성화되며 세포 분열의 여러 단계를 조절한다고 보고되고 있으며, 이러한 Aurora 인산화효소의 기능을 고려할 때 세포 분열 과정에서 Aurora 인산화효소와 반응하는 새로운 기질 및 이들의 조절인자 발굴과 기능 연구가 절실히 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 발암 단백질인 Aurora 인산화효소와 항암 단백질인 RASSF1A가 세포 내에서 특이적으로 결합하고 RASSF1A가 Aurora A 와 B에 의해 각각 인산화된다는 것을 밝혔다. 이러한 인산화는 RASSF1A의 Ser203 아미노산에서 일어나며 세포 분열시기에 따라 Aurora A와 B에 의해 각각 다른 세포내 위치에서 순차적으로 일어난다는 것을 RASSF1A의 인산화된 Ser203에 특이적인 항체를 제작하여 in vivo에서 증명하였다. siRNA를 이용하여 인위적으로 Aurora A 단백질의 발현을 억제시키거나 인산화가 일어나지 않는 RASSF1A S203A 돌연변이의 과발현은 세포 분열 진입 이후의 세포 주기 진행을 현저하게 저하시켰으며, 이는 세포 분열 시기중 일련의 방추체 조절 제어 작용과는 독립적으로 일어나는 현상임을 증명하였다. 이러한 세포 분열 시기의 조절은 이미 알려진 RASSF1A의 Cdc20에 대한 저해 작용이 Aurora A에 의한 RASSF1A의 Ser203 인산화로 인해 억제됨으로써 APC-Cdc20의 활성이 유도되고, Cyclin의 분해가 촉진된다는 것을 증명하였다. 이러한 결과들은 S203A와는 반대로 RASSF1A의 S203D돌연변이에 의해 APC-Cdc20 활성화가 증가되고 Cyclin의 분해가 유도되어 세포 분열 진행이 촉진되는 결과와 일관성을 보였다. 또한, 본 연구자는 RASSF1A가 세포 분열 시기의 후반 부분에서 Aurora B에 의해 Ser203이 인산화되며, 인산화된 RASSF1A는 SNARE 단백질인 Syntaxin16을 세포 분열 말기에 중요한 세포질 분열 소기관에 제대로 위치하도록 유도함으로써 정상적인 세포질 분열을 조절한다는 것을 밝혔다. 이는 siRNA에 의한 인위적인 Aurora B 단백질 발현의 저해로 유도된 비정상적인 Syntaxin16의 위치 지정이 RASSF1A의 S203D 돌연변이 발현에 의해 정상적으로 그 위치가 복구되어 세포질 분열이 정상적으로 일어난다는 결과를 보임으로써 일관되게 증명하였다. 따라서 본 연구에서는 Aurora 인산화효소에 의한 RASSF1A의 인산화가 세포 분열 진행 시기 조절 및 세포질 분열에 기능함을 증명하였다.
또다른 발암 유전자인 Skp2는 세포 주기 중 G1-S기로의 진행에 관여하는 SCF 복합체의 구성 인자 중 하나로, 인산화된 기질을 인지하여 SCF 복합체로 결합을 유도함으로써 그 기질의 분해를 촉진시킨다고 보고되었다. 본 연구에서는 Skp2가 RASSF1A와 결합하여 이를 분해시킴으로써 G1-S기로의 진행을 조절한다는 것을 밝혔다. SCF-Skp2에 의한 RASSF1A 단백질 분해는 Cyclin D-Cdk4 인산화효소 복합체에 의해 RASSF1A Ser203의 인산화로 그 기작이 매개되며, RASSF1A의 S203A 돌연변이의 과발현은 세포의 G1-S기로의 진행이 지체된다는 것을 확인하였다. 반대로, Skp2의 과발현은 세포 증식을 유도하였으며, RASSF1A의 항암 단백질로서의 세포 증식 억제 기능을 저해시켰다. 인위적으로 Skp2 단백질의 발현을 억제하였을 경우 야기되는 대표적인 현상인 G1-S기로의 세포 주기 진행지체는 RASSF1A 단백질 발현을 동시에 억제시킴으로써 정상적으로 회복된다는 것을 siRNA transfection방법을 이용하여 증명하였다. 이러한 결과들은 SCF-Skp2에 의한 RASSF1A 단백질의 분해가 세포 주기의 중요한 조절인자로 작용한다는 것을 뒷받침하고 있다.
결론적으로 본 연구자는 항암 단백질 RASSF1A의 발암 단백질 Aurora 인산화효소나 Skp2에 의한 인산화 및 단백질 분해가 세포 증식과 생존에 중요한 기작임을 증명하였다.
