We developed a synthetic cellular system for in vivo protein function optimization through directed evolution. Unlike conventional protein directed evolution techniques whose mutagenesis and selection are carried out in vitro, in our system a target gene is mutated and selected in vivo. Because the mutagenesis and selection are carried out by cells, the process to optimize a protein is just to culture cells. Such a simple process enables protein evolution to be automated and as a result such automated system could be used for massive protein evolution. For selection we used the fact that cells expressing different level of β-lactamase show different growth rate and susceptibility to antibiotics, such as aztreonam. In the developed system, the β-lactamase is designed to be expressed proportionally to the activity of a target gene. After selection, cells are treated with the chemical mutagen, ethylmethane sulphonate, for mutagenesis. During mutagenesis, not only target gene but also host chromosome would be mutated, which may alter cell susceptibility and growth rate. In order to eliminate false selection, a target gene-containing plasmid is rescued as a phage from the host and then the phage is infected into fresh host cell. These selection and mutagenesis procedure are repeated until the target gene is optimized. To evaluate our system and to find optimal experiment conditions, we developed a mathematical model of protein directed evolution, and showed that the system works efficiently. We constructed the designed synthetic in vivo evolution system and evolved a transcription factor, luxR, as a model system. The system optimized the gene efficiently. The system could be used for other types of protein optimization if a protein’s activity is converted to transcriptional efficiency.
최근 복잡한 생물 시스템 개발을 공학적인 관점에서 시도하는 합성 생물학 분야가 각광받고 있다. 합성 생물학에서 만드는 시스템은 매우 다양하지만 기본적으로 살아있는 미생물이 어떤 특정 기능을 수행하도록 만드는 경우가 대부분이다. 그 기능은 목적은 다양한데, 미생물 대사산물의 수율 향상을 위한 경우 생산량이 최대가 되도록 미생물이 스스로를 조절하게 만들기도 하며, 주변 환경을 감지하여 스스로 어떤 결정을 내릴 수 있는 연산을 수행하기도 하며, 다른 미생물과 신호를 주고 받음으로써 전체 미생물 군 차원에서 새로운 행동을 나타내게 할 수도 있다. 즉, 미생물 스스로가 주변을 감지하고, 스스로 판단하고 결정할 수 있는 시스템을 만드는 것이다. 미생물 스스로가 할 수 있다는 점은 곧 외부의 간섭이 덜 필요하다는 말이며 그로 인해 어떤 실험을 미생물이 수행하게 함으로써 전체 시스템을 단순화, 자동화 시킬 수 있는 장점이 있다.
본 연구에서는 유도 진화가 세포 내에서 일어나도록 만드는 세포 시스템을 개발하였다. 시스템의 목적은 미생물 내에서 돌연변이와 자연선택이 수행되도록 함으로써 전체 진화 과정의 실험을 단순히 미생물을 배양하기만 하면 되도록 만드는 것이다. 이로써 우리가 개발한 미생물을 이용하여 유도 진화를 자동화하며, 이를 이용해 산업적으로 유용한 단백질을 대량으로 진화시킬 수 있는 기반을 구축하였다.
개발한 세포 시스템에서 돌연변이 유도는 돌연변이 유도 화합물(EMS)을 이용하며, 자연선택은 배지 속 항생제 농도 (AZT) 및 미생물 내에 존재하는 항생제 분해 효소(β-lactamase)의 양에 따라 결정되는 미생물의 성장 속도 차이를 이용한다. 유도 진화를 수행하는데 필요한 요소들로 돌연변이율, 자연선택 시 사용하는 항생제 농도, 유도 진화에 사용할 전체 미생물 수 등이 있다. 이 요소들은 진화 효율을 결정짓는 것이므로 최적의 값을 찾는 것이 중요하다. 이를 위해 돌연변이와 자연선택에 관한 수학적 모델을 세우고 실험을 통해 모델의 적합성을 보였다. 세포시스템을 실제로 제작하고, 모델링을 통해 찾은 최적 실험 요소 값을 기반으로 실제 유도 진화를 수행하였다. 진화 대상으로는 V. fisheri 미생물에 존재하는 luxR 전자 조절 인자이며, 본 연구에서 개발한 시스템은 해당 전사 조절 인자를 성공적으로 진화 시켰다.
현재의 시스템은 전사 조절 인자를 성공적으로 진화시켰다. 효소의 경우에도 그 반응물이 다른 전사 조절 인자의 활성도에 영향을 주는 경우 그 조절 인자를 시스템에 포함시킴으로써 효소 기능의 최적화에 사용 가능하다. 마찬가지로 항체와 같은 경우도 단백질 결합을 전사 조절로 변환 가능한 모듈을 추가함으로써 가능하다. 이렇듯 현 시스템을 기반으로 다양한 종류의 단백질 최적화에 응용할 수 있다. 또한 본 시스템은 단백질 최적화 과정을 세포 배양만으로 가능하도록 단순화하였기 때문에 진화 과정을 자동화하고 산업적으로 유용한 단백질의 진화를 대량으로 처리할 수 있도록 할 것이다.
