The several systematic approaches in metabolic engineering have been successfully applied to the improvement of microbial strains for the overproduction of desired bioproducts. However, various in silico methodologies for systemic analysis are necessary to be improved, which allow more precise data set and another prediction strategy for strain improvement, which is successful strategy identifying genes for the flux amplification. No doubt that the development of systematical strategy for the identification of genes responsible for the improvement of producing strain by the genetic amplification will be challengeable in functional genomics era. In here, we report a new strategy of combining the advantages of constraints-based metabolic flux analysis and $^{13}C$ -constrained flux balancing analysis. The new strategy allows more accurate determination of metabolic fluxes by employing the mass balances around artificial metabolites and the converging ratio determinants (CRDs) as additional constraints. Furthermore, this improved methodology allows the pathway analysis of metabolic network model with some experimental constraints. In addition, we developed flux scanning based on enforced objective flux (FSEOF) based on constraints-based analysis with genome-scale model to select gene targets for the amplification of fluxes. In application, we presented the examples of strain improvement for enhanced production of lycopene, poly(3-hydroxybutyrate), shikimic acid, and recombinant protein in E. coli by using the gene amplification for the predicted genetic targets identified by FSEOF.
보다 정확하고 용이하게 대사흐름을 분석하고자 대상 생물의 대사 네트워크 모델에서, 방사선 동위원소로 표지된 탄소원을 이용한 성장실험 데이터로부터 특정 대사 흐름간의 상관관계비를 구하고, 이를 가상 대사산물을 이용하여 화학양론 매트릭스에 적용하여 선형계획법에 의거한 대사흐름을 분석함으로써, 정확하고 신속한 결과값을 얻어낼 수 있음을 증명하였다. 이는 특정 대상 생물을 선정하여 대사회로 모델을 구축한 다음, 특정 대사흐름간 상관관계비를 CRD 로 정의하고, 대사흐름 측정실험을 통해 대사흐름간의 상관관계비를 결정하여 화학양론 메트릭스에 적용하고, 이를 기반으로 선형계획법에 의거한 대사회로 전체 대사흐름의 프로파일을 작성하는 단계를 포함하는 대사흐름 분석기술의 개량방법을 제공하여 보다 간단한 알고리즘을 이용하여 적은 시간내에 기존의 FBA방법론에 비해 보다 정확한 세포내 대사흐름값을 제공하게 되었다. 또한 이러한 기법을 응용하여 pathway analysis등의 대사네트워크모델에 대한 특정 환경조건에서의 topological analysis를 가능하게 하였다.
이어서 대사회로분석 연구를 통하여 구축된 대사 회로를 이용하여 산업적으로 유용한 대사산물 생산시 과생산을 유도하는 증폭 대상 유전자 대한 예측 기술인 FSEOF 개발하였다. FSEOF algorithms은 constraints-based flux analysis를 근간으로 한다. 특히 genome-scale metabolic network를 이용하여, target metabolite의 flux를 optimal(또는 initial) flux value로부터 theoretical maximum yield까지 단계별로 증가시키는 simulation을 통해 얻어진 intracellular flux distributions을 이용한다. 이때, 모든 내부 flux values의 각 단계별 증감의 패턴을 살펴보고, 이들 profiles중에서 target metabolite(product)가 생산되는 flux 가 증가함에 따라 flux의 절대값이 동시에 증가하는 모든 내부 fluxes를 일차 증폭대상 유전자로 선별하는 것이 기본적인 단계이다. 구체적으로, 유용물질 생산을 위한 대상생물의 대사회로 모델에서, 유용물질의 생산관련 대사흐름의 최적값 및 최대값을 구하고, 그 최적값과 최대값 사이의 구간에서 대사흐름값의 절대값이 증가하는 대사흐름 및 그 대사흐름에 관련되는 유전자를 선별하고 이를 도입 및/또는 증폭함으로써 유용물질 생성 생물을 개량할 수 있음을 확인하였다. 이 과정을 통해 결국 유용물질을 생산성 향상을 위한 증폭대상 유전자를 스크리닝 하는 방법을 제공하였다. 이러한 과정을 통해 라이코펜, 쉬키메이트, PHB, Coenzyme Q10등의 몇 가지 대사산물에 덧붙여 재조합 단백질 생산 시스템에 적용하였으며, 목적 유용물질의 생산관련 대사흐름값을 인위로 조절하면서, 전체 대사흐름을 분석하고, 분석된 대사흐름으로부터 증폭대상 대사흐름 및 관련되는 유전자를 선별하였고 또한 이를 실험을 통하여 증명하였다. 재조합단백질의 경우에 있어, 기 구축된 대장균 대사회로모델에 재조합 단백질을 합성하는 반응식을 추가로 도입하고 예측기술을 실행하였다. 예제모델의 재조합 단백질로는 GFPuv, IL12p40, leptin, silk protein등을 사용하였다. 선별된 유전자들 중 80~90% 반응식은 아미노산 생합성 과정에 관여하는 반응식으로서 단백질 생성에 있어 그 재료가 되는 아미노산을 필요로 한다는데 있어 당연한 결과라 하겠다. 결국 이들을 제외하여 단백질 생산 향상을 위한 생산균주 개량을 위하여 최종적으로 ppc, pntAB, pta, ackA등의 유전자들을 선별하였다. 따라서 예측 결과를 바탕으로 그 대상 유전자에 대하여 그 예를 실험을 통하여 직접 증명 하였다. 걸러진 대상 유전자들이 실제 라이코펜 생산에 어떤 영향을 미칠 것인지에 대해서, 대장균에 대상 유전자를 발현벡터를 통해서 도입한 결과 1.1~1.7배 증가하는 것을 확인할 수있었다. 재조합단백질 예제에 대하여 선별된 유전자들 중 2종의 유전자를 발현벡터에 삽입하고, 대장균에 도입하였다. 이는 실험 결과 기본 생산균주 대비 특정 유전자의 증폭의 경우 재조합 단백질의 함유량이 1.3배에서 1.5배 증가하였다. 최종적으로 Coenzyme Q10예제를 이용하여 기존에 알려진 유전자손실 예측기법 (MOMA)와 FSEOF를 융합하여 각각 대상 유전자를 예측하고 이를 직접 실험을 통하여 관찰 하였다. 그 결과 두 단계에 걸친 유전자 손실 재조합 대장균의 경우 13%의 증가율을 보였으며, 이 균주에 추가적으로 증폭대상 유전자를 과발현시킴으로서 17%의 Coenzyme Q10 농도가 증가함을 증명하였다. 결과적으로 모든 후보군에 대한 실험에서 생산량 증대의 효과를 보지는 못하였지만 대사네트워크모델의 성질을 이용하여 적은 범위의 실험 대상 후보군을 제시하였다는 것에 의의가 있다 하겠다.
