A genetically defined L-threonine production strain of Escherichia coli was constructed by rational metabolic engineering. Feedback inhibition of aspartokinase I and III by L-threonine and L-lysine, respectively, were removed by site-directed mutagenesis and the native promoter containing the transcriptional attenuator leader regions of the thrABC operon was replaced with the tac promoter. The lysA and metA genes were deleted to make more precursors available for L-threonine. The point mutation in the structural gene of ilvA and deletion of tdh gene were carried out to prevent the threonine degradation. This engineered TH07 strain harboring a plasmid overexpressing the threonine operon showed a yield of 0.146 g L-threonine per g glucose.
Engineering of central carbon metabolism, especially anaplerotic pathways, was performed based on comparative transcriptome analysis with the aid of in silico simulation approach. Promoter replacement of the native ppc promoter with a trc promoter and deletion of iclR gene for activating glyoxylate shunt enzymes led to the enhanced production of L-threonine by 51%.
From the transcriptome profiling, further improvement was achieved by deletion of tdcC gene which encoding an anaerobic threonine transporter and amplification of three kinds of threonine exporters. The resulted TH27C strain (TH07 $\Delta iclR$ Pppc::Ptrc tdcC::$Cm^R$) overexpressing the $thrA^{S345P} BC$, rhtC, rhtA, and rhtB was able to produce 11.8 g/l L-threonine from 30 g/l glucose in batch culture, resulting in a impressively high yield of 0.393 g L-threonine per g glucose. Finally, based on in silico simulation approach, an improved strain more applicable to industrial fermentation process was developed by replacing a native acs promoter with the strong trc promoter, threreby decreasing the acetate accumulation during fermentation. With fed-batch fermentation, 82.4 g/l of L-threonine was produced from 280 g/l of glucose after 50 hours cultivation.
These results suggest that an industrially competitive strain can be developed by complete rational metabolic engineering based on combined rational modification, transcriptome analysis and in silico simulation analysis.
기존의 아미노산 생산균주들은 반복적인 무작위 돌연변이법에 의하거나 이와 같이 개발된 변이주에 추가적인 유전공학적 변이기법 (recombinant DNA technology)의 도입으로 제작되었기 때문에 미생물에 도입된 모든 유전적 변이들을 정확하게 파악하기 어렵다는 특성을 가지고 있다. 또한 확인되지 않은 다수의 변이들이 존재하기 때문에 추가적인 균주개발 전략 수립에 어려움이 크다는 단점을 가지고 있으며 아미노산 생산성에 악영향을 줄 수 있는 변이들도 함께 도입되었을 가능성도 가지고 있다. 따라서 3대 발효아미노산중의 하나인 쓰레오닌에 대하여 위와 같은 단점들이 배제된 고수율의 생산균주를 최근 개발된 omics 기법들을 이용하여 개발하고자 연구를 진행하였다.
첫째로, 기존의 연구들을 통하여 이미 알려진 다양한 아미노산 조절기작 및 아미노산 생합성 경로에 대한 정보들을 선별적으로 도입하여 쓰레오닌 생산균주를 제작하였다. 쓰레오닌의 생합성에 관여하는 주요 조절기작들을 해제하였으며 쓰레오닌의 합성과 경쟁관계에 있는 대사경로 및 분해경로들을 제거 또는 약화시키고 쓰레오닌 생성 오페론을 증폭하여 0.146g L-threonine/g glucose의 수율을 갖는 쓰레오닌 생산균주를 제작할 수 있었다.
둘째로, 쓰레오닌 과량생산을 위하여 변형이 요구되는 목표유전자들을 선별하기 위하여 대장균 야생주와 쓰레오닌 생산주 TH07 (pBRThrABC)에 대한 비교전사체 연구(comparative transcriptome analysis)를 수행하였다. 이로부터 아스파테이트계 아미노산 생성의 전구체인 oxaloacetate의 합성에 영향을 줄 것으로 예상되는 ppc 유전자의 전사(transcription)수준이 낮은 것을 확인하여 이를 증폭하였으나, 예상과는 달리 쓰레오닌의 생산성이 오히려 감소되는 것을 확인하였다. 이에 in silico simulation을 수행하여 ppc의 carbon flux 변화량과 쓰레오닌 생성량의 변화를 예측하고 이를 근거로 생산균주의 지놈에서 ppc 유전자의 프로모터를 trc 프로모터로 교환하여 ppc 유전자의 증폭 정도를 조절함으로써 쓰레오닌의 생산성이 증가된 균주를 개발하였다. 또한 비교전사체 연구 결과, 증가된 것으로 확인된 glyoxylate shunt 효소들을 도입하기 위하여 그 조절인자인 iclR 유전자의 결손을 도입하였다. 그 결과 ppc 유전자의 프로모터를 교환하고 iclR 유전자를 결손하여 glyoxylate shunt 의 효소들을 활성화함으로써 약 51%의 쓰레오닌 생산 증가를 확인하였다.
셋째로, 추가적인 균주 개량을 위하여 비교전사체 연구(comparative transcriptome analysis) 결과를 근거로 쓰레오닌의 운반 관련 유전자들을 결손 또는 증폭하여 0.393g L-threonine/g glucose의 고수율의 쓰레오닌 생산균주를 개발하였으며 이의 산업적 적용 가능성을 확인하기 위하여 fed-batch fermentation을 수행하였다. 그 결과 77.1g/l의 높은 농도의 쓰레오닌 생산에 성공하였으나 발효후반부에 부산물인 아세트산이 7.85g/l 까지 축적되고 동시에 당 소모속도와 쓰레오닌 생성속도 지연등의 문제점이 발생함을 확인하였다. 이와 같은 문제점의 해결을 위해 변이가 요구되는 목표 유전자를 선정하기 위한 방법으로 in silico simulation을 수행하였으며 그 결과, 아세트산의 세포내 재사용에 관여하는 효소를 coding하는 acs 유전자를 선별하였다. acs 유전자의 활성증대를 위하여 지놈에서 acs 유전자의 프로모터를 trc 프로모터로 바꾼 균주를 제작하였다. 새롭게 제작된 균주는 fed-batch fermentation시, 발효후반부 아세트산이 약 70.1% 감소 (2.35g/l) 되고 발효시간이 단축되며 쓰레오닌은 82.4g/l로 증가되어 모균주와 비교시 쓰레오닌 생산성 (g/l/h)이 약 20.4% 증가하는 결과를 나타내었다.
위와 같은 결과들은 기존의 알려진 정보들과 transcriptome 분석 및 in silico simulation 기법에 근거하여 선별된 변이 목표유전자들을 체계적으로 도입함으로써 고수율의 쓰레오닌 생산균주의 개발이 가능함을 말해준다. 또한 이와 같은 연구방법은 다른 유용한 대사산물의 생산균주 개발에도 적용가능 할 것으로 예측된다.
