This study is designed for developing a fluorescent immobilization method using click chemistry allowing a direct and non-destructive verification of immobilization for PNA microarray. We used a chemical reaction synthesizing a fluorescent triazole compound through copper (I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition from non-fluorescent molecules. We firstly verified fluorescence of synthesized triazole molecule from combining azidocoumarin and phenyl-acetylene in solution state by UV-visible and photoluminescence spectroscopy. Spectroscopic results exhibited that the product has excitation and emission peak around at 360nm and 430 nm respectively. Identifying fluorescent feature of triazole compound, azidocoumarin-linked PNA was spotted on the phenyl acetylene modified glass and reacted in click condition. The fluorescence from immobilization and hybridization are separately confirmed by array scanner since the wavelength of the immobilized region is different from that of target-labeled fluorescence. This fluorescent immobilization can serve a cost-reducing quality control method for PNA microarray.
이 연구는 click chemitry를 이용한 PNA의 형광 고정화를 통해 직접적으로 PNA microarray을 제공할 수 있는 방법을 제안한다. microarray는 유전자 돌연변이 및 유전자 발현 정도를 검색할 수 있게하는 해당 생체분자가 표면에 고정화 되어있는 기판을 말한다. 산업과 과학계의 기술 발전에 의해 microarray 기술은 한번에 수백 종의 돌연변이를 진단할 수 있고, 이제는 하나의 염기 서열에서 변이가 발생하는 경우도 SBE(Single Base Extention)에 의해 검출할 수 있을 정도의 수준에 도달해 있다. 그러나 이런 첨단의 microarray방법도 해당 생체분자가 기질 표면에 제대로 고정화 되어있지 않으면, 여기서 나오는 결과는 신뢰성을 잃게 된다. 이에 많은 연구자들이 보다 효율적인 고정과 내지 품질관리(Quality Control, Q.C.)에 대한 연구를 하였다. 그러나 이러한 연구들의 성과가 긍정적이어도 실제 microarray 제작회사의 입장에서 Q.C.를 위해서는 실제로 셈플링 테스트에 의해 나머지 제품들의 상태에 대해 추정할 수 밖에 없었고 이는 생산단가의 상승으로 이어진다. 따라서 microarray를 사용하지 않고 탐침의 고정화 상태를 알 수 있는 방법이 있다면 생산원가 감소와 품질의 직접적 확인 두 가지 장점을 얻을 수 있을 것이다.
한편 Sivakumar와 그의 동료들이 2004년에 제안한 합성법은 3’위치에 azide기가 달린 분자와 phenyl acetylene간의 Huisgen dipolar cycloaddition 반응을 통해 형광이 생기는 triazolyl coumarin 분자를 제조하는 과정을 보고하고 있다. 이 연구에 따르면 원래 coumarin계 분자는 강한 형광을 띠고 있으나 3번 위치에 붙은 azide 기에 의해 형광이 quenching 되는데, acetylene 과 반응하여 triazole 결합이 만들어지고 azide에 의한 quenching 효과가 사라지기 때문에 형광이 다시 발현되게 된다. 이를 이용하여 본 연구에서는 형광 고정화법을 고안하였는데, PNA를 사용한 이유는 PNA의 화학적 안정성과 상보적인 표적 DNA와의 혼성화가 DNA보다 더 강하게 일어나기 때문이다.
우선 microarray상에서 click 반응 후의 일어나는 분자의 실제 형광의 파장을 알아내기 위해서, 형광 발색 부분과 매우 유사한 구조의 우선 아민 말단을 갖고 있는 유리를 카르복시산이 달린 phenyl acetylene을 결합시켜 triazolyl coumarin을 만들었고 이 분자의 형광 특성을 UV-vis 분광기와 photoluminescence 분광기를 통해 확인하였다. 이 화합물의 흡광파장과 발광파장은 각각 340 nm 와 430nm 였다. 그리고, phenyl acetylene말단으로 유리표면을 개질 시킨 후, 여기에 azidocoumarin (AZCO)이 연결된 PNA를 arrayer를 통해 spotting 하였다. 24 시간의 반응 시간 후 세척한 다음 형광스케너로 이 PNA microarray를 확인하였는데, 결과 그림에서 보는 것과 같이 spotting되어 있는 부분에서 형광 신호가 들어왔으며, 이를 통해 고정화가 제대로 이루어졌고, 이것의 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
그리고 본 연구에서 만들어진 microarray가 제대로 구현되는지 합성 DNA 올리고머를 혼성화시켜 보았다. 이 또한 결과 그림에서 보는 것과 같이 혼성화 시킨 DNA와 상보적인 부분에서 형광신호가 강하게 검출되었다. 이를 통해 본 연구에서 목표하였던 새로운 형광 발생 고정화에 의한 microarray의 제조에 성공하였고 이는 비파괴 Q.C.방법으로 사용될 수 있을 것으로 기대한다.
