Importance of C4 compounds has been mentioned for a long time because of their applications and usefulness in industry. There have been a lot of efforts to substitute microbial process of producing four carbon materials for current petroleum-based process expensive and harmful to environment. We describe a method for developing the homo-production of a valuable C4 compound, succinic acid, by metabolic engineering of Mannheimia succiniciproducens MBEL55E based on its in silico experimental data. Construction of in silico metabolic network model of M. succiniciproducens with the complete genome sequence database facilitated to target the genes to be manipulated, and to develop optimal chemical defined medium. In combination with this defined medium, the targeted strain M. succiniciproducens PALK $(ldhA::Km^{r} pta-ackA::Sp^{r})$ shows homo-production of succinic acid with trivial amount of by-products through the entire fermentation. This study provides a novel method of in silico-based metabolic engineering of microorganisms to achieve homo-production of a metabolite, and pulls up the competitiveness of microbial process in industrial biotechnology.
숙신산은 C4 화합물로, 현재 산업적으로 유용한 물질로 사용되고 있으며 앞으로 그 사용범위와 중요성이 높아질 것으로 예상되고 있다. 숙신산은 대부분 석유 화학공정을 통해 화학 합성되고 있으나, 이는 환경적으로 심각한 부작용을 낳는다. 따라서 미생물을 이용한 자연친화적인 숙신산의 생산이 필요하다. 하지만 이를 산업적으로 이용하기 위해서는, 석유화학공정을 통해 이루어지는 현재의 숙신산 생산에 버금가는 경제성과 효율이 뒷받침되어야 한다.
앞서 살펴보았듯이, 이번 연구에서 우리는 우리 실험실에서 동정한 맨하이미아 숙시니시프로듀센스 MBEL55E 균주를 이용하여 대사공학적인 방법으로 숙신산 생산을 향상시킬 수 있는 공정을 개발하는 데 주력하였다. 우선 다양한 발효 조건 변화를 통해 맨하이미아 야생 균주의 특성을 파악하고, 맨하이미아 균의 대사 회로를 바탕으로 유전자 과발현을 통해 숙신산 쪽으로의 대사 흐름을 증가시키고 부산물의 생산을 감소시키려는 노력들을 기울였다. 각각의 실험에서 긍정적인 결과들을 얻었지만, 몇 가지 중요한 문제들을 모두 극복하지는 못하였다. 이에 우리는 맨하이미아 균의 가상 세포 모델을 만들어 MetaFluxNet 프로그램을 이용한 여러 시뮬레이션을 전개, 대사회로를 분석하였다. 가상 세포 모델에 현실성을 부여하기 위해 맨하이미아 균주의 바이오매스 반응식을 결정하기 위한 필수적인 실험들을 전개하여 반영하였다.
가상 세포 모델의 시뮬레이션 결과를 바탕으로 한 맨하이미아 균의 대사 공학에 의해, 우리는 마침내 숙신산 단일 생산 공정을 이룰 수 있었다. 맨하이미아 균의 게놈 정보를 이용하여 만들어진 가상 세포 모델은 조작해야 할 후보 균주들을 선택하고 최적화 합성 배지를 개발하는 데 유용하게 사용되었다. 시뮬레이션 결과를 기반으로 실제 맨하이미아 균주의 유전자 조작을 수행하여 맨하이미아 숙시니시프로듀센스 PALK 균주$(ldhA::Km^{r} pta-ackA::Sp^{r})$ 를 만들었고, 여기에 최적화 합성 배지를 결합하여, 다른 부산물들을 거의 생산하지 않고 숙신산만을 대량으로 생산하는 고효율 숙신산 단일 생산공정을 개발하였다.
이 연구는 인실리코에 기반한 대사 공학적 기법을 통해 미생물에서 우리가 목적으로 삼는 대사 산물의 단일 생산 공정을 개발하는 새로운 방법을 제공하며, 이로 인해 산업적 수준으로 미생물을 이용한 목적 물질 생산 공정을 실용화할 수 있는 가능성을 높였다는 데 그 의의가 있다.
