Temperature is the essential factor for the survival and influence various life phenomena such as behavior pattern, cellular metabolism, and physiological process. So most animal have abilities to find appropriate temperature for surviving and maintaining body temperature, and to avoid harsh temperature such as freezing and burning. However, the molecular mechanism mediating temperature preference has been pooly decribed. Among techniques, calcium imaging has become a standard technique in diverse areas of biology in general, and neuroscience in particular, reflecting the many cellular roles and actions of this ion as a second messenger and as a carrier of charge. Calcium can stimulate biological cascades and changes in gene transcription, mediate synaptic potentials, and trigger vesicle release. Various genetically encoded fluorescent sensors can monitor change in intracellular calcium concentration. circularly permuted GFP variants are singly sensitive to physiologically calcium ions. We use a circularly permuted green fluorescent protein(cpEYEP). These sensors show very low fluorescence in the unbound state, but increase emission intensity considerably after binding calcium. By using the Gal4-UAS system in Drosophila, we can make one fly strain, carrying the inversepericam DNA under the control of an upstream activator sequences(UAS). When another fly strain expressing Gal4 in a cell type-specific manner is crossed with UAS strain, the progeny will express the inversepericam, GFP signals in the specific region reflecting the expression pattern of the Gal4 line. By using the device for assaying preference for temperature, the fly(MB247 Gal4/UAS-TNT-E) showed abnormal temperature preference. That result revealed Mushroom bodies plays important roles on the temperature sensing. So we designed the $Ca^{2+}$ imaging on mushroom bodies during temperature fluctuation. We compared the result in Mushroom bodies with other parts in larvas. Mushroom bodies and specific regions of the larva expressed slightly different patterns to the temperature fluctuation.
Temperature fluctuation can be the important factor for explaining the circadian clock pattern in Drosophila. Ambient-temperature fluctuations can serve as a synchronization signal, which is somewhat surprising given that circadian clocks are temperature compensated. But when exposed to temperature cycle, wild-type Drosophila can be synchronized(Wheeler. D.A, 1993). This “temperature entrainment” requires a functional clock because flies mutant for per($per^{01}$ loss-of-function mutants) merely respond to temperature change. We have tried to reveal the connection between the temperature sensing with the circadian oscillation. Above all, to identify genes involved in temperature preference, a large scale of mutant library(more than 27,000 mutant genetared by P element mutagenesis in Drosophila)was used for reference. Among the lines, exhibiting the specific phenotype, we chose some and did the locomotor tests. As a result, we found the candidate genes which is possibly involved in thermosensing and circadian clock in Drosophila.
생물체에서 온도는 매우 중요한 환경요소로써, 외형 세포대사 행동양상과 같은 다양한 생명현상에 영향을 끼친다. 대부분의 동물들은 자신의 체온 유지를 위해 생존에 적합한 온도를 찾아가는 능력을 가지고 있다. 따라서 미생물에서부터 포유류에 이르기까지 주위온도를 감지하고 그에 따른 적합한 반응을 하도록 하는 기작을 발달시켜 왔다. 우리는 온도감지의 과정에서 여기에 관여하는 신경세포활동의 결과로써 칼슘농도가 변한다는 것을 생각할 수 있었다. 이 점에 착안, 칼슘이온과 반응하여 GFP signal을 보이는 Circularly permutated GFP의 일종인 inversepericam를 사용하였다. 또한 실시간으로 in-vivo상태에서 외부에서 원하는 온도변화를 샘플에 줄 수 있는 장치를 하여, UAS-Gal4 system과 함께 초파리 brain의 특정부위에서 온도변화에 따른 칼슘이온 signal을 imaging하였다. 그 결과, 초파리 brain에 있는 Mushroom body와 ganglion 그리고 brain 부분이 아닌, wing disc 부위에 온도를 상승, 하강시킬때 각각 다른양상을 보였다. 즉, 각 부분이 온도변화에 따라서 반응한다는 사실을 알 수 있었다.
많은 동물들이 세포 수준의 상태에서부터 실제 행동에 이르기까지 다양한 형태로 생체리듬을 보인다. 이러한 생체리듬은 낮과 밤의 변화나, 온도변화와 같은 외부자극에 의해 만들어지고, 생체내 존재하는 유전자의 주기적 활성에 의해 지배를 받는다. 우리는 온도감지라는 생리적 특성과 일주기성 조절이 연관되어있을 수 있다는 가정하에, screening을 통하여 얻어낸 비정상적인 온도선호도를 보이는 대량의 돌연변이 초파리 이용하여, 역시 비정상적인 일주기성 리듬을 보이는 line들을 선별하게 되었다. 선별된 EP line들과 wild type 파리 각각에서 RT-PCR을 통하여 P element 주위의 유전자의 transcription level를 비교하였다. 그 결과, transcription양이 더 많거나 적어진 유전자들을 온도감지와 일주기리듬에 관여할 것이라 생각되는 candidate gene으로 정하게 되었다. 또한 그 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 가지고, domain의 특성과 기능에 대하여 알아보았다. 이런 특징들을 가지고, 선별된 유전자가 온도감지와 일주기리듬에 어떻게 관여하는 지를 밝히는데 시발점이 될 것이다.
Mura라고 알려진, 유전자에 위치한 두 EP line에 대하여, 온도선호도와 일주기리듬에 대하여, 실험을 해본 결과, 비정상적인 양상을 보였다. 두 EP line에서의 Mura 유전자에 대한 transcription양 또한 정상 초파리에서보다 많이 감소하거나, 조금 증가되는 결과를 보였다. 또한 Mura와 two-hybrid작용하는 유전자를 검색하여 알아낸 후, 이 유전자에 대한 deletion line을 만들어, 온도선호도와 일주기리듬에 대하여, 실험을 해본 결과, 역시 비정상적인 양상을 보였다. 따라서 우리는 Mura가 온도감지와 일주기리듬에 관여하는 유전자일 수 있다는 결론과 함께, 더 많은 실험을 통하여 이를 밝혀낼 필요가 있다고 생각하게 되었다.
