Enzymes are widely used in many chemical synthesis and medicines. The use of enzymes in industrial production is newly emphasized for environment-friendly and sustainable development. For their industrial use, enzymes are needed improved characteristics such as specificity, stability, enantio-selectivity and high-level expression. Enzymes from nature have been modified to have improved properties by rational engineering or directed evolution method. In recent years, computational methods for the design of enzyme have been available by the wealth of structural data and increasing computing power.
In this research, computational design method was developed for the improved substrate specificity of hydantoinase. Major concern in the design was how to set biological constraints in terms of computable terms. From the main idea of computing minimum energy structure, many modified terms and constraints were applied to increase accuracy while reducing calculation time. Basic computation system is composed of energy calculation with Amber force field, various calculation parameters, rotamer library and MC optimization. Enzyme-ligand docking modes were prepared before energy calculation. Several hundred docking modes were selected while target amino acids positions were mutated to alanine and while distance between catalytic carbon of hydantoin and nucleophilic water molecule was conserved. Target residues were selected based on structural investigation, mechanistic knowledge and preliminary experiments. Initially two kinds of approach were applied, which were fixed model and dynamic model. The calculation parameters were optimized separately according to each model. After the design calculations were performed, experimental candidates were selected and the activities of them were analyzed. Following the first design procedure, the parameters of the scoring function were modified to fit new experimental rank order. As the rounds proceeded, the specific activity of best mutant was increased. 3 rounds of iterative design yielded an enzyme with 200-fold increased specificity toward HPH than hydantoin. Detailed analysis on transition state modeling also supported the experimental results.
The design of functional elements is a valuable method for the generation of new-functional enzyme. The complexity and large change of sequence space in functional elements mutation hampers the application of design method. Here, the idea of computational method for the design of functional elements (loops) was expressed and tested. The design of loops was divided into structural fitness and activity fitness. The structural fitness was convinced through secondary structure alignment and 3-dimensional structure alignment. The activity fitness was check by protein family profile and binding energy calculation with rotamer change. The loops of hydantoinase were design to have activity toward HPH. First design on tight restriction yielded 3 candidates who all have marginal activity even with 6 to 19 large amino acid differences. Second design on less restriction yielded 5 new candidates with 7 to 20 mutations, and 3 of them showed almost no activity. Only 1 of them had 45-fold increased specificity and these results proved that the used computational method is useful tool to find fitness mutants among large sequence space.
생물산업의 발전으로 그 중요성이 더욱 강조되고 있는 효소의 특성을 개발하기 위해 다양한 방법들이 존재해왔으며, 최근 들어 발전된 컴퓨터의 계산능력과 단백질들의 다양한 구조, 기능에 대한 정보들로 인해 컴퓨터를 이용한 단백질 설계 방법이 새롭게 시도되고 있다. 컴퓨터를 이용한 계산적 방법의 단백질 설계는 단백질의 성질을 계산이 가능한 항목으로 표현하고 특성을 유지할 수 있는 제한 조건을 정립한 이후에 효소의 다양한 변이체에 대한 설계와 실험의 반복을 통해 적용된다. 본 연구에서는 이러한 단백질 설계 기술을 구현할 구체적인 시스템을 구축하고 평가하였다.
효소의 기질 특이성을 향상 시키기 위한 아미노산의 설계를 위해서 우선 효소와 기질 간의 결합에너지에 기반을 둔 scoring function을 구축하였다. 계산에 필요한 다양한 매개변수들을 조정하여 계산된 에너지 순위가 실험적으로 이미 나와있는 단백질 변이체의 순위대로 예측할 수 있도록 하였다. Hydantoinase를 대상으로 하여 효소의 활성 부위에서 구조와 작용 메커니즘을 고려하여 변형을 시킬 아미노산을 선정하였다. 변형될 위치에 결합될 다양한 기질의 결합모양을 미리 docking simulation을 통해서 예측하며, 이 때 기질이 움직이면서도 효소활성을 유지하기 위한 제한조건을 설정해 주었다. 설계위치의 아미노산의 종류와 그 모양, 즉 rotamer가 달라짐에 따라 기질결합에 따른 에너지를 계산하여 순위를 매기고 이를 실험적으로 검증하였다. 새로운 실험결과는 scoring function의 매개변수를 추가, 조정하는 데 이용되어 더욱 정확도가 높아진 함수를 만들어내었으며 3번의 반복적인 계산과 실험을 통해 최종적으로 hydroxyphenylhydantoin (HPH) 기질에 대해 기질 특이성이 200배 가까이 증가한 변이효소를 설계, 창출할 수 있었다.
효소의 기능요소는 효소의 성질을 획기적으로 변화시키기 위해 더욱 중요시되고 있으며 그 시간적, 노동적 어려움을 극복하기 위해 계산적 방법이 개발되었다. 기능요소, 주로 loop 들이 서열, 길이, 모양 등이 효소의 기능을 결정하는 데 핵심이 되는 것을 감안하여, loop의 2차 구조 비교, 3차 구조의 유사성 비교, 기능과 관련하여 family profile 검토, 최종적으로 rotamer에 따른 기질과의 결합에너지 계산을 통해 후보를 선별하였다. 제한 조건의 정도에 따라 최종적으로 HPH에 대해 기질특이성이 45배 증가한 hydantoinase를 설계, 창출할 수 있었으며, 이는 기능요소 설계 기술이 sequence space의 다양한 부분을 탐색할 수 있는 가능성을 제시하였다.
이상의 개발된 기술들을 통하여 단백질의 기질 특이성을 향상 시킴에 있어서 컴퓨터를 이용한 계산적 방법들이 충분히 활용되어 sequence space에서 적합한 후보(fitness candidates)를 찾는 데 유용한 도구로 이용될 수 있음을 보여주었다.
