Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is very powerful tool to study the dynamic features of bio-molecules in solution state, which is similar with physiological condition. Base pair opening reaction occurring in DNA duplex can be investigated by observing hydrogen exchange of imino protons in guanine and/or thymine residues. Base-catalyzed dynamics experiments provides opening/closing rate of the base pair and thus, equilibrium constant for base pair opening. Subsequently, thermodynamic energies for the base pair opening reaction can be derived from those dynamic parameters. Dynamics of three different DNA duplexes have been studied using the NMR spectroscopy.
Methylation of DNA plays a regulatory role in DNA metabolism. Hemimethylated GATC site plays key roles for various cellular processes including negative modulation of replication initiation at oriC by SeqA. Investigation on DNA duplex that contain fully methylated GATC site is need to explain how hemimethylated GATC sites are recognized in vivo in a background of fully methylated ones. NMR was used to characterize the solution structure of the DNA duplex that contained a fully methylated GATC site and the dynamics of the un-, hemi-, and fully methylated GATC duplexes. Unique major groove conformation optimized for entrance into the cleft structure of SeqA was displayed in only hemimethylated GATC site. The apparent equilibrium constants for base pair opening of the three differentially methylated GATC duplexes displayed the effect of N6-methylation of the adenine residue upon the dynamics of its own and adjacent base pairs. Faster base pair opening rate and less energy requirement for the base pair opening of the two G˙C base pairs in the hemimethylated GATC duplex might be an important factor for recognition by SeqA protein.
The cis-syn cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) is cytotoxic and mutagenic UV-induced DNA photoproducts. In general, the nucleotide excision repair (NER) pathway is responsible for the repair of bulky DNA lesions. However, CPD lesion is rarely recognized by XPC-hHR23B, the primary damage recognition protein of the NER pathway, and thus poorly repaired. Interestingly, double T·G mismatches in CPD lesion which induce large helical distortion and instability considerably enhanced the binding affinity of XPC-hHR23B. Also, artificial bubble-like structures were displayed to be well recognized by XPC-hHR23B. Dynamics studies of CPD-containing DNA duplexes were required to elucidate the damage recognition mechanism of XPC-hHR23B. DNA duplexes containing matched, a single 3’-T·G, or a double T·G mismatched CPD lesion were investigated in this study. The formation of a CPD lesion at the central T-T site of the DNA duplex barely affects the thermal stabilities of the DNA duplex. In contrast, the T·G mismatches in a DNA duplex have severe effect on its own and neighboring base pairs. Intriguingly, six consecutive base pairs in the CPD/GG duplex were excessively destabilized compared to other duplexes. Those instabilities are expected to facilitate the formation of a bubble-like structure in DNA, which is known to be recognized efficiently by the XPC-hHR23B.
Left handed Z-DNA is characterized by its zigzag arrangement of the phosphate backbone, alternation of the anti- and syn-conformation of the base, and only one groove which is analogous to the minor groove in B-DNA. Formation of Z-DNA is unfavorable, but certain factors including Z-DNA binding proteins can facilitate it. Z-DNA binding domain (Z$\alpha$) of double-stranded RNA adenosine deaminase (ADAR1) ($hZ\alpha_{ADAR1}$) was used to investigate B-to-Z conformational transition. DNA-protein complexes with several stoichiometric ratios have been investigated by various experiments such as proton exchange rate measurement, CD spectroscopy, gel filtration chromatography, and observation of chemical shift changes. Based on these studies, the existence of intermediate complexes in the B-Z transition has been identified. Those results can provide insight for the better understanding of molecular mechanism of B-to-Z conformational transition by the $hZ\alpha_{ADAR1}$ protein.
NMR 분광분석법은 수용액 상태에서 핵산 혹은 단백질과 같은 생 분자들의 동역학적 성질을 연구할 수 있는 강력한 실험 방법이다. DNA에서 염기쌍 열림 반응은 구아닌 및 티민 염기의 이미노 수소 교환 현상을 이용해서 조사할 수 있다. 본 연구에서는 세 가지의 다른 DNA 시스템에 대하여 NMR을 이용한 동역학적 연구를 수행하였다.
메틸화된 DNA는 생체 내에서 여러 중요한 역할을 한다. 대장균 내에서 반메틸화된 GATC 서열은 SeqA 단백질에 의해 인식되어, oriC에서 일어나는 DNA 복제 시작 조절에 관여한다. 그런데, 실제로 대부분의 GATC 서열은 전메틸화된 상태로 존재하므로, 전메틸화된 GATC 서열과 반메틸화된 GATC 서열의 어떤 차이점이 단백질들에 의해서 인식되는 지 알 필요가 있다. 본 연구를 통해, 구조적인 측면에서 반메틸화된 GATC 서열의 독특한 major groove가 단백질의 인식에 중요함을 알 수 있었다. 동역학적인 측면에서는 GATC 서열 양 끝의 두 G·C 염기쌍이 반메틸화된 GATC 서열의 경우 상대적으로 빠른 염기쌍 열림 속도가 빠르고, 이 반응이 일어나기 위해서 적은 에너지가 필요한 것으로 나타났다. 이는 단백질에 의해 인식되는 DNA의 관점에서 반메틸화된 GATC 서열이 에너지적으로 더 선호될 수 있음을 의미한다.
DNA는 자외선에 노출되면 여러 손상을 입는데 그 중 대표적인 것이 TpT 서열에서 발생하는 cis-syn cyclobutane-pyrimidine dimer (CPD)이다. CPD 손상은 일반적으로 염기 절단 수리법에 의해서는 잘 복구되지 않는데, 그것은 초기에 손상을 인식하는 XPC-hHR23B 단백질이 CPD 손상을 인식하지 못하기 때문이다. 그런데 유독 T·G mismatch가 이중으로 존재하는 경우는 인식이 잘 된다. CPD 손상 및 mismatch의 개수를 달리한 6개의 DNA 에 대해서 동역학적 연구를 수행하였고, CPD 손상이 발생하거나 T·G mismatch가 생길 경우 DNA의 안정성 및 유동성에 어떤 영향을 주는지 확인하였다. 특히 CPD 손상 부위에 이중 T·G mismatch를 가지는 DNA의 경우는 6개의 연속된 염기쌍이 불안정해져서 방울모양의 구조를 이루게 되어 단백질이 인식하게 되는 메커니즘이 제시되었다.
Left handed Z-DNA는 골격 구조, groove 형태, 그리고 염기의 배열에서 B-DNA와 그 성질이 매우 상이하다. Z-DNA는 에너지적으로 불안정한 형태이지만, Z-DNA 결합 단백질의 도움을 받아 형태를 유지할 수 있다. 본 연구에서는 인간에서 발견되는 탈아민효소인 ADAR1 단백질이 가지고 있는 Z-DNA 결합 부위를 이용하여 DNA에서 일어나는 B-Z 전이 현상을 관찰하였다. 단백질 적정 과정에서 나타나는 이미노 수소 교환 속도의 변화, 다양한 온도에서의 1차원 NMR 실험, 그리고 DNA 존재 유무에 따른 단백질 HSQC 스펙트럼의 화학 이동 변화 등을 토대로 중간 단계의 물질들의 존재를 예측할 수 있었다.
