An acidic pH shock implementation for the enhancement of geldanamycin production and enhancement of acidic-pH shock tolerance and geldanamycin secretion by heterologous expression of a putative $Na^+/H^+$ antiporter have been studied. A preliminary study on effects of different pH-shock modes on secondary metabolism in S. coelicolor A3(2) showed that only acidic-pH shock affected secondary metabolism positively. With this evidence, various ways of acidic-pH shock implementation were tried for geldanamycin production in batch culture of S. hygroscopicus JCM4427. About two-fold enhancement of geldanamycin production was achieved with an abrupt pH shift from 6.1 to 5.0. Excessively strong or frequent acidic-pH shocks, however, caused cell damage resulting in extremely low geldanamycin production. This was considered to be potentially a major obstacle in applying pH shock technique. To overcome this problem, the development of pH shock tolerant strains was considered to be indispansable. $Na^+/H^+$ antiporters were expected to give a solution to this problem of overcoming the adverse effects of pH shock application. It was anticipated that when heterologously expressed, it could enhance the pH shock tolerance of the host by adding to the system its capability of pH homeostasis. In order to confirm its potentials in enhancing pH shock tolerance, a putative $Na^+/H^+$ antiporter of SCO3185 (designated as sha4) originated from S. coelicolor A3(2) was expressed in cation/$H^+$ antiporter-deficient E. coli strains and S. hygroscopicus JCM4427. Recovery of cation efflux activity, and enhancement of acidic-pH shock tolerance and salt tolerance were observed when sha4 was expressed in these E. coli strains. The sha4-transformed S. hygroscopicus JCM4427 showed a higher enhanced cell growth and geldanamycin production than the host strain under $K^+$ stress. Under $Na^+$ stress no significant differences were observed. No significant enhancement of geldanamycin production due to the incoperation of sha4 into S. hygroscopicus JCM4427. Interestingly, secretion of geldanamycin was much enhanced upto 93 % in the sha4 transformant. Such useful characteristics of sha4 of enhancing salt tolerance and product secretin could provide valuable tools for the improvement and simplification of bioprocesses. Furthermore, the combination of acidic-pH shock implementation and utilization of the sha4 gene could suggest a new strategy in the development of high-productivity bioprocesses for secondary metabolites production.
1. S. coelicolor A3(2)를 고체배양 중에 두 가지 다른 방식의 pH충격을 가하게 되면, 산충격 (F-pHS)의 경우 엑티노로딘의 생산량이 증가하는 반면에 알칼리충격 (R-pHS)을 가하게 되면, 엑티노로딘 생산량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 두 가지 pH 충격 후, 배지의 pH는 24시간 후에 두 경우 모두 중성 pH로 회복되는 것을 확인 할 수 있었다. 세포생장의 경우 pH 충격에 영향을 받지 않는 것으로 조사되었다. 본 연구에서는 DNA 마이크로어레이를 이용해 pH 충격에 따른 세포내 유전자 발현 양상을 조사하였다. 엑티노로딘 생산관련 유전자의 경우, 엑티노로딘 생합성 조절유전자인 actII-ORF4와 엑티노로딘 수송단백질인 actVA-ORF1와 actII-2의 발현이 F-pHS에서 발현양이 증가 되는걸 확인할 수 있었지만, R-pHS의 경우 그 발현양이 감소하였다. 스트레스 관련 유전자의 경우, 산충격을 적용한F-pHS 조건에서는 arginine deaminase의 발현이 증가됨을 확인 할 수 있었다. 이는 산충격에 의해 세포내부에 증가되는 산도를 arginine의 아민기를 방출시켜 중화시켜 산성화에 의한 세포피해를 최소화 해주려는 기작으로 사료된다. 알칼리 충격을 적용한 R-pHS의 경우, alkaline shock protein의 발현이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라, oxidative stress에 관여하는 유전자인 super oxide dismutase (sodF2, sodN) 의 발현이 F-pHS, R-pHS 두 조건 모두에서 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 pH shock이 다른 스트레스 관련 유전자의 발현에도 영향을 미치는 상위 스트레스임을 의미한다.
2. 젤다나마이신 생산균주인 Streptomyces hygroscopicus JCM4427 배양 중 여러가지 방법으로 산충격을 적용해 젤다나마아신 생산성 향상 연구를 수행하였다. 5리터 생물배양기에서 2.5리터 M2 배지를 사용해 28도에서 6일간 배양하였으며, 1N HCl 혹은 1N NaOH을 이용해 pH 충격을 가하였다. 배양 중 pH를 조절하지 않은 경우 최대 젤다나마이신의 생산량은 414 mg/l 였다. 배양 중 pH를 6.9~7.0로 유지하며 배양한 경우 최대 젤다나마이신 생산량은 317 mg/L 였다. pHS1 조건에서는 배양 중 48시간째에 배지를 pH 5.0으로 떨어뜨린 후, 일정하게 유지하며 배양하였다. 이때 최대 젤다나마이신 생산량은 768 mg/L 였다. pHS2의 경우 48시간째에 배지를 pH 5.0으로 떨어뜨린 후 일정하게 유지하다가 96 시간째에 pH 6.0으로 회복시켰다. 최대 젤다나마이신 생산량은 429 mg/L 였다. pHS3의 경우는 너무 많은 산충격에 의해 젤다나마이신이 생산되지 않았다.
3. Streptomyces coelicolor A3(2)유래의 putative $Na^+/H^+$ 안티포터인 SCO3581 (sha4)를 대장균과 Streptomyces hygroscopicus JCM4427 균주에서 이종발현 시켜 산충격 내성, 염도 내성, 그리고 젤다나마이신 분비성 향상 연구를 수행하였다.
대장균의 $Na^+/H^+$ antiporter 인 nhaA 가 제거된 균주 (KNC)와 이 균주에에 sha4를 도입한 균주 (KNS4)의 $Na^+$와 산충격에 대한 내성 향상 여부를 비교하였다. 그 결과 KNS4가 KNc에 비해50mM 의 $Na^+$ 에 내한 내성이 향상되는 것을 확인 할 수 있었다. 또 산충격 수 KNS4가 KNC에 비해 높은 생존율을 보임을 확인하였다. 뿐만 아니라 두 균주 배양 중 400mM NaCl을 가해 염충격을 가한 결과, KNS4가 KNC에 비해 더 빨리 세포내부로 들어온 $Na^+$를 밖으로 배출해 내는 것을 확인하였다. 이를 통해 S. coelicolor A3(3) 유래sha4 유전자가 대장균의 $Na^+/H^+$ 안티포터와 같은 기능을 갖고 있음을 확인 하였다.
대장균의 $K^+/H^+$ antiporter 인 kefB 가 제거된 균주 (KKC)와 이 균주에 sha4를 도입한 균주 (KKS4)의 $K^+$와 산충격에 대한 내성 향상 여부를 비교하였다. 그 결과 KKS4가 KKC에 비해100mM 의 $K^+$ 에 내한 내성이 향상되는 것을 확인 할 수 있었다. 또 산충격 후 KKS4가 KKC에 비해 높은 생존율을 보임을 확인하였다. 뿐만 아니라 두 균주 배양 중 400mM KCl의 염충격을 가한 결과, KKS4가 KKC에 비해 더 빨리 세포내부로 들어온 $K^+$를 밖으로 배출해 내는 것을 확인하였다. 이를 통해 S. coelicolor A3(3) 유래sha4 유전자가 대장균의 $K^+/H^+$ 안티포터와 같은 기능을 갖고 있음을 확인 하였다.
sha4 유전자를 젤다나마이신 생산균주인 S. hygroscopicus JCM4427에 이종발현 시켰다. M2 배지에 NaCl과 KCl을 각각 0~600 mM을 넣고 염농도에 따른 젤다나마이신 생산량을 확인하였다. 배지내NaCl의 농도의 따른 젤다나마이신 생산성 경우 sha4를 도입한 균주와 대조군 사이의 생산성 차이는 없었다. 하지만, 배지에KCl을 넣었을 경우 sha4를 도입한 균주의 젤다나마이신 생산성이 대조군에 비해 높은 것으로 나타났다. 이를 통해, sha4 유전자가 S. hygroscopicus에서 발현 시, KCl에 대한 내성을 부여함을 확인 할 수 있었다.
뿐만 아니라, sha4를 도입한 경우, 젤다나마이신 분비성이 크게 향상되는 것을 볼 수있어다. 대조군의 경우 69 %의 젤다나마이신이 배지로 분비되었지만, sha4 도입 균주에서는 93 %의 젤다나마이신이 배지로 분비되었다. 이러한 현상은 미생물 유래 유용물질 생산공정에 있어 가장 큰 비용을 차지하는 분리, 정제 비용을 획기적으로 줄일 수 있는 기반 기술을 제공할 수 있으며, 이를 통해 가격 경쟁력 있는 효율적인 미생물 기반 유용물질 생산공정 확립에 기여 할 수 있을 것이라 사료된다. 또한, sha4 도입을 통한 산충격 내성균주를 이용해 산충격을 이용한 미생물 공정 중 세포사멸을 막아줌으로서 좀 더 유연한 산충격 공정 개발에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
