A new class of nanoparticle based gene delivery carrier assembled from semiconductor quantum dots (QDs) and polyethyleneimine (PEI) has been developed and utilized for the intracellular trafficking of small interfering RNA (siRNA) as well as the gene silencing. Positively charged PEI was covalently conjugated on the surface of QDs to induce spontaneous charge interactions with cyanine dye labeled vascular endothelial growth factor siRNA (cy-VEGF siRNA) for the formation of nano-sized polyelectrolyte complexes (PECs). Due to the condensed structure of QD labeled PECs, fluorescence resonance energy transfer (FRET) was achieved between cy-VEGF siRNA and PEI conjugated QDs. The resultant PECs offered valuable information about the intracellular pathways of gene delivery carrier and the cytosol specific release of siRNA by the FRET mechanism. From confocal microscopic analysis, intracellular uptake and release of siRNA from the PECs were visualized as a function of incubation time. In addition, the extent of siRNA release from the PECs was quantitatively evaluated by a flow cytometric analysis. An alternative intracellular pathway of siRNA was explored using PEI conjugated QDs modified with the protein transduction domain (PTD) from human transcriptional factor Hph-1. Two kinds of siRNA/QDs PECs have shown different intracellular uptake mechanisms and trafficking pathways of siRNA. Both siRNA/QDs PECs offered superior VEGF gene silencing efficiency in serum condition compared to the conventional gene delivery agents such as lipofectamine and PEI. The present study demonstrates that the PEI conjugated QDs can be utilized not only as a versatile tool to analyze intracellular trafficking pathway but also as an efficient gene delivery carrier for therapeutic RNA.
유전자 치료법에 많이 사용되고 있는 siRNA는 악성 종양뿐만 아니라 혈관계 질환, 자가면역질환 등 여러 가지 질환을 치료할 수 있는 약물로써 각광받고 있다. 21-25개의 핵산으로 이루어진 이 물질은 유전자 전달체와 함께 복합체를 이루어 세포내 포획과정(endocytosis)을 통하여 세포 내로 유입되고, 전달체로부터 떨어진 siRNA는 세포질에서 상보적 mRNA와 결합하여 유전자 발현을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 최근 효율적인 siRNA 전달을 위하여 유전자 전달체에 관한 관심이 높아지고 있는 가운데, 이를 위하여 유전자/유전자 전달체 복합체에 관한 세포내 경로를 분석하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 연구에서는 나노 반도체인 양자점과 폴리에틸렌이민을 이용한 유전자 전달체를 개발하고, 유전자 발현을 저해시키는 데뿐만 아니라, siRNA의 세포내 메커니즘을 분석하는데 이용하였다. 양이온을 띄는 폴리에틸렌이민을 양자점에 접합한 후, 형광 염료(cyanine dye)가 붙은 siRNA와 전기적 결합을 통하여 200nm 크기의 복합체를 제조하였다(Figure 1 and Figure 2). 이 유전자 전달체와 siRNA가 복합체를 이룰 때 나타나는 FRET현상으로 세포내 경로뿐만 아니라 siRNA의 세포내 방출을 측정하고자 하였다(Figure 3). 먼저 양자점이 결합한 폴리에틸렌이민과 여기에 PTD 일종인 Hph-1을 결합한 두 가지 종류의 전달체를 이용하여 siRNA의 시간별 세포내 유입과 방출을 공초점 현미경으로 관찰하였다(Figure 4). 또한 유체 세포 측정법(FACS)을 통하여 정량적인 분석을 할 수 있었는데, 이 방법은 기존의 이미지를 기초로한 분석방법에 비해 보다 정확하고 신속하게 siRNA 유입과 방출을 정량적으로 분석할 수 있어, 효율적인 전달체 개발을 위한 기초적인 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다 (Figure 5).
또한 이 두 전달체는 기존에 사용하고 있는 전달체에 비해 뛰어난 유전자 발현 저해를 보임으로써(Figure 6), 양자점이 결합한 폴리에틸렌이민이 유전자/유전자 전달체의 세포내 경로를 분석하는데 뿐만 아니라 효율적인 유전자 전달을 위한 전달체로써도 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다.
