Flap endonuclease 1 (FEN1) is a structure-specific endonuclease that removes flap structure arising in several DNA metabolisms such as DNA replication, repair and recombination. In this study, we report that human replication-factor C (RFC) complex markedly stimulated all types of nuclease activities of human FEN1 (FEN1) in an ATP-independent manner. The amount of RFC was much less (<200 fold) than that of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in order to stimulate FEN1 to a comparable extent. Various kinetic parameters indicate that the mechanism by which RFC stimulates FEN1 is distinct from that by PCNA. Each subunit of RFC retained stimulation activity of FEN1, fully or partially, even when it was heat denatured. With systematic deletion analyses of RFC4 subunit, we defined three regions that were able to stimulate FEN1. The strongest stimulation one comprised amino acids 170 to 194 in RFC4 that contained RFC box VII. We also found that the four residues Tyr182, Glu188, Pro189, and Ser192 were critical for FEN1 stimulation. Therefore, the presence of a number of stimulatory motifs in one molecule of RFC and its ability to stimulate FEN1 greatly at low levels render RFC a critical partner for catalytic function of FEN1 required for processing of Okazaki fragments in eukaryotes.
Flap endonuclease 1 (FEN1)은 lagging strand DNA 합성 시 DNA polymerase $\delta$의 displacement synthesis에 의해 생성되는 DNA flap을 제거 하여 연결 가능한 nicks을 만드는 단백질이다. 유전학적 연구를 통해 FEN1의 돌연변이는 유전체의 불안정성을 유발하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 Okazaki 절편들의 효과적인 연결은 곧 유전체 안정성 유지에 필수적이라 할 수 있다. 이를 위해서 생명체는 상호보완적인 시스템을 진화시켜 왔는데, 대표적인 예로 Dna2 단백질이 있다. Dna2는 replication protein A와 더불어 길어진 flap을 FEN1이 제거 가능한 길이로 선처리 하는 역할을 수행한다. 이와 더불어 FEN1은 또한 자신의 최적의 활성을 유지하기 위해 다른 단백질들과 직접적으로 상호작용을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 그 예로, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Werner, Bloom, 그리고 Rad9-Rad1-Hus1이 FEN1과 직접적으로 상호작용하여 FEN1의 활성을 증가시킨다고 보고되었다. 또한, 이들 중 Werner와 Bloom은 dna2-1 mutant의 표현형을 억제하는 것으로도 보고되었다. 이러한 실험적 근거는 lagging strand 합성과정에 있어서 FEN1의 최적활성을 유지하는 것이 아주 중요하다는 것을 의미한다. 따라서, 본 연구는 보고된 단백질들 외에 FEN1의 활성을 증가시킬 수 있는 단백질의 추가 존재 유무의 확인에 기초하였다. 본 연구를 통해 우리는 replication factor C (RFC)가 FEN1의 활성을 아주 효과적으로 증가시킨다는 것을 발견하였다. RFC는 다섯 개의 단량체로 이루어진 복합단백질로 DNA 합성의 초기단계에서 PCNA를 ATP 에너지를 이용하여, 성장하는 DNA 말단으로 안내하는 역할과 함께 DNA polymerases의 교환에 역할을 한다. RFC에 의한 FEN1활성 증가는 ATP 에너지의 사용과 무관하였으며, 지금까지 보고된 다른 어떤 단백질들보다 효과적으로 FEN1의 활성을 증가시켰다. 이는 RFC가 현재까지 가장 많이 연구된 PCNA보다 약 200배의 FEN1 활성증가 효과를 보였다는 것으로 증명되었다. FEN1 활성증가 효과는 RFC 다섯 개의 단량체 모두에 보존되어 있으며, 열을 가하여 RFC의 변성을 유도한 뒤에도 FEN1 활성증가 효과는 유지되었다. 이는 열 안정성을 갖는 견고한 구역이 RFC에 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 광범위한 단백질 절단 실험을 통해 FEN1 활성증가 효과를 갖는 세 구역을 정의 하였고, 추가적으로 이에 중요한 단백질 잔기를 발견하였다. 이는 RFC가 FEN1 활성 증가에 있어서 다른 단백질 보다 우선적인 역할을 담당할 것이라는 것을 의미한다. 결론적으로, 우리는 본 실험결과를 토대로 DNA 합성복합체의 일부로 존재하는 RFC에 의한 FEN1 활성증가가, 유전체 안정성 유지에 있어서 가장 우선적인 메커니즘이라는 것을 제안했다.
