The culturability and diversity of abundant members of the domain Bacteria in freshwater sediment was investigated by a combination of various cultivation strategies and cultivation-independent 16S rDNA-based techniques. To capture an overall fraction of culturable bacteria from the sediment, a universal approach was carefully designed for adjustment of culture conditions, which comprised unsupplemented lake water as a medium, cycle of light and darkness, ambient temperature with a long-term incubation, anaerobic condition and use of the most-probable-number (MPN) single-cell quarantine technology. Bacterial culturability was examined with various MPN estimators that provided different levels of viable counts, which were for total bacterial fraction, colony-forming-bacteria (CFB) fraction, liquid-turbidifying-bacteria (LTB) fraction and total cultivated-bacteria fraction. Total count was indirectly measured by a new combination of epifluorescence microscopy and MPN estimation, resulting in a fast and non-biased result that was evaluated later by successful extinction of cells in most of the MPN culture plates. The cultivated population accounted for 13.4 % of the total count, which was approximately 60-160 times larger than the case of the colony forming population, indicating a remarkable improvement of microbial culturability compared to the classical plating technique. Growth turbidity was not effective in detecting bacterial culturability as the fraction of LTB was only 0.8 % of the total count. An isolate collection of 222 strains was then established by plating on oligotrophic medium and phylogenetically compared with a clone collection of 72 16S-rDNAs by sequencing and in silico amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). On the basis of cluster analyses according to sequence similarity or ARDRA patterns, both of the collections were statistically stable in terms of species richness and evenness especially when they were subjected to lineage-specific rarefaction studies. A majority of clones and isolates were affiliated to the class Betaproteobacteria of which members have been known to play important roles in freshwater sediment. Phylogenetic correlations between the two collections were especially found in the lineages Rhodocyclaceae, Bradyrhizobiaceae, Sphingomonadaceae and Oxalobacteraceae. Although clonal members belonging to major lineages Deltaproteobacteria and Firmicutes were not successfully cultivated, members of another major lineage Bacteroidetes and the families Burkholderiaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae and Xanthomonadaceae were found as only cultured forms. In addition, approximately 39 % of the total isolate-phylotypes (75-100 % in case of fastidious lineages) comprising 70 strains were affiliated to novel taxa, indicating an effectiveness of the cultivation strategy. Among those novel groups, Burkholderiaceae and Bacteroidetes, which could be captured only by the cultivation study, gave rise to proposals of two novel taxa Burkholderia sediminicola sp. nov. and Ferruginibacter gen. nov., both of which were well differentiated from their related taxa in terms of polyphasic characteristics. All of those results still predict a limit to the isolation of unculturable sediment bacteria, particularly Deltaproteobacteria. But as long as no universal approach aimed at the cultivation of an overall microbial population in freshwater sediment is available, this study suggests optimistic accounts of the culturability and diversity of sediment microbes.
다양한 배양기술과 배양 비의존적인 방법을 통하여 담수 침전물에 우점하는 진정세균의 배양성과 다양성을 연구하였다. 침전물에 서식하는 전체 미생물을 대상으로 하기 위해서, 담수를 직접 배지로 사용하여, 반복적인 명암 조건과, 혐기적 상온에서의 장기간 배양, 최확치 단일 세포 격리법 등을 응용하여 하나의 보편적 배양법을 주의깊게 고안하였다. 세균의 배양성은 기본적으로 미생물 총수, 군락형성 단계, 현탁 성장 단계, 그리고 외적으로는 성장 판별이 불가능한 단계 등을 최확치 통계로 산출하였다. 특히 미생물 총수는 형광현미경법에 최확치기술을 융합한 새로운 간접계수법을 이용하여 계수하였으며, 최확치 단일 세포 격리 배양 플레이트에서 추정 미생물수에 합치되는 순수 배양체 수를 발견함으로써 이 간접계수법의 정확성을 입증하였다. 본 배양법은 전체 미생물의 13.4 % 를 배양시킴으로써 종래의 평판 배지법에 비해 60배에서 최대 160배까지 향상된 효율을 보였다. 현탁 성장하는 미생물군은 전체 미생물의 0.8 %에 불과 하였다. 이를 통해 저영양성 평판 배지를 경유하여 총 222 균주를 분리하였으며 이를 침전물에서 직접 분리한 72개의 16S rDNA 클론과 염기서열 및 in silico amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) 를 이용하여 비교분석하였다. 염기서열 유사도 및 ARDRA 패턴으로 묶은 phylotype 분석 결과, 배양체 군집과 클론 군집 모두 종 부유성 및 종 균등성이 안정된 것으로 나타났다. 특히 분류군 단위로 세분화시켜 희박화분석한 경우 이 특성이 더 두드러졌다. 두 군집에서 주로 발견된 분류군은 기존에 담수 침전물에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 Betaproteobacteria 였다. 특히, Rhodocyclaceae, Bradyrhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Oxalobacteraceae 등의 과에서 두 군집사이의 상호연관성이 관찰되었다. 비록 클론 군집에서 주로 발견되었던 Deltaproteobacteria, Firmicutes 등이 배양과정에서 소실된 것으로 파악되었지만, 반면 Bacteroidetes 를 비롯하여 Burkholderiaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae, Xanthomonadaceae 등의 분류군에 속하는 세균들은 오로지 배양체로만 발견되었다. 게다가 70 균주에 달하는 39 % (까다로운 미생물군의 경우 75-100 %) 의 phylotype 이 신분류군으로 파악된 것으로 미루어, 본 연구에서 사용된 배양법의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 이 과정에서, 오로지 배양체로만 발견된 두 분류군 Burkholderiaceae, Bacteroidetes 로부터 두 개의 신분류군을 각각 Burkholderia sediminicola sp. nov., Ferruginibacter gen. nov. 이라는 이름으로 제안하였다. 이들의 유전형적, 표현형적 특징 및 화학적분류형질이 기존에 알려진 다른 연관 세균과 충분한 분류학적 거리를 두고있음을 파악하여, 이들의 신종 및 신속으로서의 위치의 타당성을 입증하였다. 위에서 기술한 결과들은 담수 침전물에 서식하는 난배양성 미생물 (특히 Deltaproteobacteria 등) 을 완벽하게 배양하는데는 아직 제한이 있음을 말해주고 있었으나, 담수 침전물 세균 배양에 대한 보편적 배양기술이 제시된 적이 없는 현 단계에서, 본 연구가 보여준 높은 배양성 및 다양성 향상은 침전물 서식 미생물 연구 방법에 희망적인 근거를 제시한 것으로 사료된다.
