Abiotic stress caused by high salt concentration, drought and cold inhibits plants` growth and limits productivity of a yield in many important agriculture field. Plant engineering strategies for abiotic stress tolerance rely on the expression of genes that are involved in signaling and regulatory pathways or genes that encode proteins conferring stress tolerance. Therefore, we isolated a new osmotic stress inducible gene, AtSIZ, which encodes a polypeptide with a $C_3H$ type zinc finger. Expression of the gene was induced by exposure of the plants to NaCl, cold temperatures, and dehydrations as well as exogenous application of ABA, although each produced a different pattern of induction. Plants with a T-DNA insertion mutation in the AtSIZ gene showed increased sensitivity to NaCl stress whereas overexpression of AtSIZ enhanced resistance to NaCl stress.
Complementation experiments confirmed that the mutant phenotype was caused by the T-DNA insertion in the AtSIZ gene. Expression studies revealed that the mutation in the AtSIZ gene specifically blocked induction of COR15a by NaCl stress but not by cold stress. In contrast, induction of RD29a by both NaCl and cold stresses was normal in the mutant. AtSIZ was able to activate transcription of a reporter gene, gal1-LacZ, in yeast cells when expressed as a fusion protein with the GAL4 DNA binding domain. Deletion experiments showed that the C-terminal region of 45 amino acid residues was not required for activation of the reporter in yeast cells.
Taken together, these results strongly suggest that AtSIZ is involved in the osmotic stress response by activating transcription of a subset of osmotic stress inducible genes.
We also carried out research on the production of transgenic Agrostis mongolica having resistance to osmotic stress for offering the diversity of commercial application in the development of valuable turf grass varieties. Although the experiments were not fully performed, we confirmed that over-expresssion of Arabidopsis AtSIZ gene in transgenic A. mongolica exhibited increased tolerance to salt. This result suggest that AtSIZ can be used to improve salt stress tolerances in monocotyledonous as well as dicotyledonous plants.
In addition, we conducted research on the development of novel screening method using proteome profiles for predicting phenotype of transgenic plants. For the genes that are not at upstream in signaling and thus give only weak phenotype, it is difficult to identify function through conventional screening. Thus, we intended to prove that the proteomic pattern analysis can be effectively used as molecular scoring and can replace the visible scoring. Using two-dimensional gel electrophoresis, we conducted a comparative analysis of intra-species proteome variation in Arabidopsis ecotypes and examined the effect of single gene mutations on parental ecotype proteome patterns. Col-0, Ler-0 and Ws-0, the three Arabidopsis ecotypes, were compared to identify characteristic proteome patterns. From the protein expression profile of whole seedling protein extracts, 12 deferentially expressed groups of proteins were distinguished through self organizing map(SOM) clustering analysis and proteins in each cluster were identified by peptide mass fingerprinting. These isolated clusters were used as a molecular phenotype for comparison of Col-0, Ler-0, and Ws-0 with genetically close or distant ecotypes, as well as several single locus mutants.
Comparison of protein patterns with other ecotypes revealed that the genetic diversity of the ecotypes was reflected in quantitative differences in the protein expression patterns.
높은 염 농도나 가뭄, 추위 등에 의한 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소 중 하나로 작용한다. 이와 같이 식물의 성장을 저해하는 환경 스트레스 있어서 가장 가혹한 스트레스는 탈수, 고염 및 추위 등 다양한 외부 조건에 의해서 야기되는 삼투 스트레스이다. 삼투 스트레스에 대한 저항성이 약간만 증가하여도 농업 생산성과 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 삼투 스트레스에 대한 조절 기작과 이에 관련된 조절 인자에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다. 따라서 본 연구자들은 식물체에 대한 환경 스트레스, 그 중에서도 특히 삼투 스트레스에 대한 저항성과 관련된 새로운 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행하였으며, 그 결과 애기 장대로부터 삼투스트레스에 의해 유도되는 신규한 유전자인 AtSIZ를 분리하였다. AtSIZ는 3개의 $C_3H$ zinc finger motif 은 가지며, C-말단 영역에 전사 활성 도메인을 갖고 있음을 확인하였다. AtSIZ 유전자는 NaCl, 저온, 탈수 및 ABA 등의 다양한 외부스트레스에 의해 발현이 유도 되었으나, 각각의 스트레스 별로 발현이 유도되는 정도 및 시간에는 차이를 보였다. AtSIZ 유전자에 변이가 생긴 경우, 식물체는 삼투 스트레스에 대해 민감성을 나타내게 되어 잎에 안토시아닌이 축적되고, 잎의 가장자리에 손상이 나타나며, 크기가 작고 황화 현상을 나타낸 반면에 AtSIZ 유전자를 과 발현하는 식물체는 고농도의 NaCl 처리 시 야생형 식물체가 생존하지 못하는 조건 하에서도 높은 생존율을 보였다. AtSIZ 유전자 변이체의 발현분석 결과, AtSIZ 유전자의 변이가 NaCl 스트레스로 인한 COR15a 의 유도는 특이적으로 억제하지만, 저온에 의한 COR15a 유도는 억제하지 않는 것으로 나타났다. 이와 반대로, 변이체에서 NaCl과 추위 스트레스로 인한 RD29A 유전자 발현 에는 영향을 미치지 않았다. 효모 단일 하이브리드 실험 결과, AtSIZ는 효모에서 리포터 유전자인 gal1-LacZ의 전사를 활성화시켰으며 이로써 AtSIZ가 전사 촉진 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
상기 연구를 바탕으로 본 연구자들은 염과 가뭄 스트레스에 우수한 잔디를 개발하고자, Agrobacterium 을 매개로한 형질전환방법을 이용하여 대표적인 한지형 잔디인 Agrostis mongolica에 비선택성 제초제 저항성 유전자(bar gene)와 AtSIZ 유전자를 도입하였다. 비선택성 제초제인 basta를 살포하여 저항성을 나타내는 개체를 분석한 결과, AtSIZ유전자는 A. mogolica genome에 삽입되어 정상적으로 발현됨을 알 수 있었다. In vitro 실험을 통해 형질전환체에 대한 NaCl 저항성을 조사한 결과, AtSIZ 유전자가 도입된 형질전환체는 야생형에 비해 우수한 저항성을 보였다. 본 결과로 볼 때, AtSIZ 유전자는 쌍자엽 뿐만 아니라 단자엽에서도 NaCl 스트레스에 대한 저항성을 보임을 알 수 있었으며 향후 다양한 작물에 응용이 가능함을 시사 하였다.
아울러 우리는 프로테옴 패턴분석을 활용하여 형질전환 식물체의 표현형을 조기에 분자수준에서 밝힐 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 그 일환으로 우선 애기장대 ecotype 간의 특징적인 단백질의 발현양상 차이와 그 관련성을 조사하였다. 애기장대의 ecotype 들인 Col-0, Ler-0, 그리고 Ws-0으로부터 얻은 이차원 전기영동 단백질 profile을 기반으로 self organizing map(SOM) cluster 분석을 통해 12개의 차별적인 발현 양상을 보이는 단백질 군을 분리하였다. 이들 분리된 단백질 군을 분자 표현형으로 이용하여 애기장대의 10가지 ecotypes(Col-0, Col-2, Col-3, Col-5, Ws-0, Ws-2, Ws, Ler-0, C24, No-0)에 대한 분별 가능성을 분석하였다. 단백질 군을 활용한 분자표현형분석을 통해 ecotype들을 효과적으로 분별 할 수 있음을 알 수 있었으며 이는, 생태형의 유전적 변화와 유사성은 단백질 발현 양상의 변화 및 유사성과 밀접한 연관을 가짐을 의미한다.
ecotype의 single locus mutants와 단백질 발현 양상비교실험 결과, 단일 유전자의 돌연변이는 대부분의 경우에 모태 ecotype의 특징적인 단백질 발현 양상에 큰 변화를 주지 않았으나, AtSIZ유전자를 비롯한 몇 몇 유전자들의 mutation은 모태 ecotype의 단백질 발현 양상에 큰 변화를 주기도 하였다. AtSIZ 유전자가 전사조절인자로 다양한 하위 유전자들의 발현양상에 영향을 준다는 점을 고려할 때 충분히 예상되는 결과 였고, 이는 본 방법을 통해 upstream regulatory genes들의 발굴에도 응용가능성을 시사한다. 본 연구에서 나온 결과를 토대로, 방법을 좀 더 개선하고 지속적으로 data를 확보한다면 가시적인 표현형이 미약하여 visible screening으로 확인이 어려운 유전자들의 발굴에 이용 가능 할 뿐만 아니라, 형질전환식물체의 표현형을 보다 정확하고 신속하게 분석 가능함으로써 GM작물 개발 시 매우 유용한 도구가 될 것으로 기대된다.
