This dissertation work focus upon the microtubule (MT), which is a bio self-assembled cytoskeletial filamentous protein as a model system of nanotube. However, the MT is a hollow tube and its interior is arguably small that a functional relevance is little known of how or why proteins or drugs interact with microtubule lumen. Here, we use fluorescence after photobleaching (FRAP) to study the binding and re-binding of the anti-cancer drug taxol to a site known to lie on the interior of the microtubule, and how it is affected by microtubule-associated protein Tau. Through FRAP measurements on a fluorescently labeled taxol on MT decorated with different tau isoforms, we discovered that Tau commonly induces taxol to bind MT cooperatively. But one of Tau isoform speeds up the rate of taxol passage through the pores on the MT wall. To understand Tau effects on taxol, quantitative modeling for mobility based on the taxol kinetics was presented and it allowed an estimation of cooperativity and mechanisms for the fast mobility. In light of these results, we discuss the extent to which these two biologically distinct ligands either compete or collaborate to facilitate escape and what the isoform effect implies about the biological functions of Tau and the MT interior.
As second topic, we study the microtubule growth inside confined space in the presence of stabilizing agent. We create the cell-sized vesicle made of lipids bilayer in vitro as a good model system of a living cell. In experimentally, we archive the evolution of vesicle containing of microtubule under the influence of taxol using optical microscopy. We reveal that the hydrophobic stabilizer, taxol, crosses the membrane and binds to MTs. It also stimulates polymerization of MT with fast growth rate and interrupts MTs bundling. Most surprising result is that MTs place just underneath of the membrane and make sharp edge despite of energetical unfavorable position. To understand what determined this shape evolution, the final morphology of MT inside vesicle was classified as several groups. We conclude that stabilizing agent modulates the mechanical properties of MTs as well as membrane.
이 논문은 바이오 자기조립 형태의 세포의 골격구조를 이루는 필라멘트 타입의 단백질인 마이크로튜블에 대한 것으로 이는 나노튜브 모델시스템으로 볼 수 있다. 이 마이크로튜블은 내부가 빈 튜브구조로서 그 내부의 부피는 매우 작다. 따라서 그 내부의 기능적면과 관련에서 어떻게 또는 왜 단백질이나 약들이 마이크로튜블 내부와 작용을 하는지 잘 알려져 있지 않다. 여기서 우리는 fluorescence recovery after photobleaching 테크닉을 이용하여 마이크루튜블 내면에서 항암제로 쓰이는 taxol의 결합과 재결합에 또 다른 안정화제인 microtubule-associate 단백질인 Tau의 영향에 대해 연구하였다. 이 FRAP을 통해서 우리는 형광처리된 taxol이 Tau가 결합되어있는 마이크로튜블에서 협동적(cooperative) 결합을 하는 것을 보였다. 또한 이 두 종류의 isoform중 한 종류만이 마이크루튜블 벽에 존재하는 구멍을 통해 taxol의 통과하는 속도를 증가시킴을 밝혀냈다. 우리는 Tau 효과에 대해 이해하기 위해 taxol 동역학을 바탕으로 한 taxol mobility에 대한 정량적인 모델을 세워 이 모델은 협동적 결합에 대한 정량적 값을 이끌어내고 빠른 mobility를 설명할 수 있는 메커니즘들을 제시하였다. 이러한 결과들에 대해 우리는 두가지 다른 종류의 안정화 ligands에 대해 경쟁과 협동 관계, 또 isoform에 결정되는 생물학적 기능에 대해서 논해보았다.
두번째 주제로서, 제한된 공간에서 안정화 에이전트가 존재할 때 마이크로튜블의 성장연구하였다. 이를 위해 우리는 인지질로 만들어진 세포 크기의 vesicle을 생체 밖에서 재구성내었는데 이는 실제 세포 시스템에 대한 적절한 모사 시스템이라고 할 수 있다. 실험적으로 마이크로튜블을 포함한 vesicle의 모양에 대한 taxol의 영향을 현미경을 이용하여 관찰하는데 성공했다. 소수성(疏水性)의 안정화 에이전트인 taxol은 세포막을 넘어 세포 안으로 침투하여 마이크로튜블에 결합하였다. 이렇게 결합된 taxol은 마이크로튜블의 성장을 촉진하는 반면 bundling을 방해한다. 가장 놀라운 영향은 에너지적 측면에서 안정하지 않는 세포막 바로 밑에 위치하여 세포막을 변형시키고 날카로운 모서리들을 만들어 낸다는 것이다. 우리는 taxol에 의한 vesicle의 형태적 변화는 나노튜브의 rigidity와 surface tension의 역학적 성질의 변화와 그 둘의 균형에 의존함을 밝혀내었다.
