Confocal microscopy enables visualization of optical sections within thick transparent objects without physical sectioning and is used for three-dimensional imaging in the life sciences and semiconductor industries. However, like other optical microscopes, the confocal microscope has poor lateral resolution in comparison with non-optical imaging devices, such as SEM (Scanning Electron Microscopy) or AFM (Atomic Force Microscopy), which can resolve atomic-level features. The low lateral resolution of optical microscopy is caused by the well-known diffraction limit. In particular, focused light has a finite volume, the size of which is determined by the numerical aperture of the objective lens and the wavelength of light. Objects with features smaller than the volume of the focused light cannot be resolved. Generally, the lateral resolution of an optical microscope cannot exceed 200 nm. In spite of many advantages of confocal microscopy, such as high speed 3D imaging, non-destructive, non-contact measurement, and molecular imaging, the low lateral resolution has limited use of confocal microscope in diverse research and industry fields which need especially high lateral resolution.
There have been many efforts to enhance the lateral resolution of the confocal microscope, such as 4Pi optics, pupil plane filters and STED. Although these imaging systems are quite effective, they are often complicated or have side-lobe problems that cause defects in the resulting images.
Structured illumination techniques have also been used to enhance the lateral resolution of the conventional epi-fluorescence microscope. In a structured illumination microscope (SIM), an object with fine periodic features is illuminated by a sinusoidal structured illumination. The superposition of these two fine periodic patterns creates moir$\eacute$ fringes in which the fringe patterns can have much lower frequencies than shown by the individual pattern. This means that high-frequency information can be moved to the low frequency region and information outside the cut-off frequency of the optical transfer function (OTF) can be observable. If we replace information that originates in the high frequency region to its original position, enhanced image resolution results. Previous research has shown that structured illumination leads to a two-fold improvement in the lateral resolution of a conventional wide-field microscope. Furthermore, use of the nonlinear relation between excitation and emission light in fluorescence microscopy allows “theoretically unlimited resolution”.
In point-scanning confocal microscopy, the object is illuminated by a point source and a point detector measures reflected or fluorescent light. A pinhole, which functions as a spatial filter, is placed in front of the point detector. Thus, the in-focus light passes through the pinhole and enters the detector; the out-of-focus light is blurred and is blocked by the pinhole. This feature allows the point-scanning confocal microscope to create three-dimensional images. Slit-scanning confocal microscopy uses line illumination and slit detection, allowing similar optical sectioning, although with a slight loss of axial resolution. The slit-scanning confocal microscope has better light efficiency and scanning speed than the point-scanning confocal microscope. If the illumination pattern has a sinusoidal variation in intensity along the longitudinal axis, there will be enhancement of resolution along that axis, just as for the SIM.
In this thesis we present a novel imaging system called the structured illumination confocal scanning microscope (SICSM). The SICSM can be simply implemented by use of structured illumination-generating optics with conventional slit-scanning confocal microscopy. Numerical simulation results show that this simple and inexpensive method can improve the lateral resolution of the slit-scanning confocal microscope by a factor of 2. If we use a nonlinear illumination technique with SICSM, “theoretically unlimited resolution” can be achieved, as with nonlinear SIM. Unfortunately, the axial resolution of the SICSM is slightly less than that of the confocal microscope. This is because our method for generating linear structured illumination pattern makes the effective numerical aperture (NA) of the objective lens decrease. This problem may be solved by use of a new method for generating linear structured illumination patterns.
This thesis discusses about three dimensional imaging theories to analyze the performance of SICSM mathematically. The point spread function (PSF) and the optical transfer function (OTF) which is useful tool representing resolution performance of an imaging system is derived. All the numerical simulation results are used to suggest optimal conditions for maximizing lateral resolution and minimizing deterioration of other imaging performances. At the end of this thesis, experimental results verify a validity of the numerical simulation results. The PSF is obtained by experimental method and the OTF is derived using the PSF. The images of line and space objects with various periods are presented to verify the lateral resolution enhancement of SICSM. Finally, three dimensional images of diversely shaped test objects observed by SICSM are presented to show axial resolution performance and compared to the images observed by commercial confocal microscopy.
공초점 현미경은 물리적인 절편 없이도 광학적으로 두꺼운 물제의 내부 광학 절편 구조를 관찰할 수 있다. 공초점 현미경의 이러한 광학 절편 능력은 시편의 3차원 영상화를 가능하게 해주며 생명 과학분야, 재료과학 분야 및 반도체 등 미세 패턴의 3차원 영상화가 필요한 분야에서 널리 사용되고 있다. 그러나 일반적인 광학 현미경과 같이 공초점 현미경 또한 분해능이 회절한계에 의해 제한 된다는 한계를 지니고 있다. 일반적으로 빛은 회절 현상에 의해 하나의 점으로 초점을 맺을 수 없으며 따라서 이 초점보다 작은 형상을 갖는 물체는 분간할 수 없다. 이러한 현상을 회절 한계라고 하며 일반적으로 광학 현미경은 회절 한계에 의해 200nm 이하의 분해능을 가질 수 없다. 공초점 현미경은 시편에 손상이 가지 않는 비접촉식 측정방식으로 고속의 3차원 영상화가 가능하다는 장점에도 불구하고 분해능이 전자 현미경이나 원자 현미경에 비해 크게 미치지 못하므로 고분해능이 요구되는 분야에서는 사용이 제한되고 있는 실정이다.
다년간 광학 현미경의 분해능을 향상시키고자 하는 노력이 계속되었으며 성공적인 연구사례가 보고되고 있다. 구조 조명 현미경도 그러한 노력의 결과물 중의 하나이다. 구조 조명 현미경은 일반 현미경과 같이 시편을 균일하게 조명하는 것이 아니라 조화 함수의 형태로 구조 조명 한다. 만일 시편에 높은 공간 주파수를 갖는 형상이 있다고 가정하면 구조 조명의 형상과 중첩하여 모아레 무늬를 생성한다. 모아레 무늬는 시편과 구조 조명 각각의 공간주파수에 비해 매우 낮은 주파수의 형상을 갖게 된다. 이러한 저주파 무늬는 사실은 높은 공간 주파수에서 기인한 것이다. 낮은 공간 주파수의 모아레 무늬는 광학 전달 함수를 통과할 수 있으므로 측정된 모아레 무늬를 해석하여 복원하면 향상된 분해능의 영상을 얻을 수 있다. 일반적으로 구조 조명 공초점 현미경은 일반 광학 현미경에 비해 최대 두 배 향상된 횡방향 분해능을 갖고 있으며 만일 비선형 조명 무늬를 사용하면 이론적으로 무한대의 분해능을 갖게 된다. 하지만 구조 조명 현미경은 향상된 횡방향 분해능에 비해 광축방향으로는 분별력은 가지지 못하는 문제점을 갖는다. 이러한 문제점으로 인해 구조 조명 현미경은 오직 광학적으로 얇은 시편에 대해서만 적용이 가능하게 되어 그 사용이 크게 제약된다.
점 주사 공초점 현미경은 시편에 점 조명을 하고 반사된 빛을 바늘구멍을 통해 측정함으로써 광학 절편 영상을 얻는다. 반면에 선 주사 공초점 현미경은 시편을 선 조명 하게 되고 반사된 빛을 슬릿 개구를 통해 측정함으로써 광학 절편 능력을 부여 받는다. 일반적으로 선 주사 공초점 현미경의 분해능은 점 주사 공초점 현미경에 비해 약간 저하되지만 광효율과 영상 획득 속도가 우수하다는 장점이 있다. 본 논문에서는 선 주사 공초점 현미경의 선 조명을 길이 방향으로 조화함수의 형태로 변조하여 구조 조명을 구현한다. 따라서 선 조명의 길이 방향으로 기존의 구조 조명 현미경과 같이 향상된 횡방향 분해능을 얻을 수 있게 되며 또한 선 주사 공초점 현미경과 같이 광학 절편 능력도 갖게 되므로 모든 방향으로 향상된 분해능을 갖는다.
본 논문에서 제안된 구조 조명 공초점 주사 현미경의 횡방향 분해능을 모의 실험을 통해 평가해 본 결과 횡방향으로는 대략 1.4배 정도의 분해능 향상을 보였으나 광축 방향으로는 기존 공초점 현미경에 비해 13% 정도 분해능이 저하됨을 확인하였다. 이러한 분해능 저하는 고주파의 구조 조명을 만드는 과정에서 대물렌즈의 유효 수치 개구가 감소하기 때문이다.
구조 조명 공초점 주사 현미경은 조화 함수 형태의 구조 조명 무늬의 위상을 세 번 바꿔 측정함으로써 영상을 복원하게 된다. 모의 실험을 통해 확인한 결과 만일 위상에 오차가 발생하게 되면 복원된 영상의 분해능이 저하되며 영상에 주기적인 노이즈가 발생함을 확인하였다. 본 논문에서는 이러한 위상 오차를 보상해 주는 새로운 알고리즘을 제안하여 이러한 문제점을 해결한다. 모의 실험을 통해 확인한 결과 제안된 위상 오차 알고리즘을 적용할 경우 위치 오차에 의한 분해능 저하가 0.1% 이하로 감소하게 되며 주기적 노이즈도 1.77% 정도의 무시할 만한 수준으로 감소함을 확인하였다.
제안된 구조 조명 공초점 주사 현미경의 분해능을 평가하고자 금 나노 입자를 측정하여 점 확산 함수를 측정 하였다. 0.8의 수치 개구를 갖는 대물렌즈와 488nm 파장의 레이저를 광원으로 사용하여 측정한 결과 점확산 함수의 횡방향 폭이 구조 조명 공초점 주사 현미경의 경우 183nm로 평가되었으며 일반 공초점 현미경은 260nm로 평가 되어 구조 조명 현미경의 횡방향 분해능이 1.42배 정도 향상됨을 확인하였다. 광축 응답의 측정을 통해 광축 분해능을 평가한 결과 구조 조명 공초점 주사 현미경이 23% 정도 분해능이 저하됨을 확인하였다.
1.7um의 단차와 10um의 횡방향 주기를 갖는 표준 시편의 3차원 영상을 복원한 결과 구조 조명 공초점 주사 현미경은 58.5nm의 광축 방향 반복능과 58.8nm의 횡방향 치수 반복능을 가짐을 확인하였다. 동일 시편을 공초점 현미경으로 복원한 결과 39.5nm의 광축 방향 분해능과 64.3nm의 횡방향 분해능을 보였으므로 구조 조명 공초점 주사 현미경은 광축 방향으로는 0.68배 정도 저하된 반복능 성능을 보이며 횡방향으로는 1.09배 향상된 반복능을 가짐을 확인하였다.
본 논문에서 제안하는 구조 조명 공초점 주사 현미경은 비교적 단순한 구조에도 불구하고 횡방향 분해능이 일반 광학 현미경에 비해 2배 정도 향상되며 공초점 현미경과 유사한 광축 분해능을 갖는다. 구조 조명 공초점 주사 현미경은 고분해능 영상 획득이 필요한 분야에서 기존의 공초점 주사 현미경을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
