I. We investigated specific binding capacity of target proteins and nonspecific adsorption property by varying the lateral density between polymer brushes grown from mixed SAMs. pOEGMA films were grown from mixed SAMs consisted of UDT and ATRP-initiator on gold substrates. After polymerization, the films were activated, and then biotin coupling was treated on the films for studying specific binding capacity of streptavidin. We found that specific binding capacity of protein was influenced by varying lateral density between polymer brushes. Moreover, the nonspecific binding/adsorption property of fibrinogen and lysozyme was detected by increasing $^{sol}\chi_{UDT}$ values ranging from 0.4 to 0.8. However, the lateral density effect is disappeared by increasing polymerization time. From our results, we expected that as increasing the pOEGMA films thickness, lateral density effect did not impacted on the biotinylated pOEGMA films; the biotinylated pOEGMA films grown from mixed SAMs have only lateral effects under 8~10 nm dried ellipsometric thickness of that films. In the AFM study, we confirmed that the gap between the polymer brushes on the surface was introduced by adding UDT to the solution of mixed SAMs. In addition, we found that all the surface areas were covered by about 8~10 nm dried ellipsometric thickness of pOEGMA films. From the AFM results, we hypothesized that the phenomena, such as starting saturation of specific binding capacity of streptavidin, decreasing or nothing of nonspecific binding/adsorption property of protein, and determining the point about the lateral density effects, related to the films thickness because 8~10 nm dried ellipsometric thickness of the biotinylated pOEGMA films covered almost all of the surface areas.
II. Herein we report selective immobilization of proteins onto cyclic olefin copolymer (COC) surface. We modified the surface with Azide-ATRP initiator by UV irradiation. After introduction of Azide-ATRP initiator on COC surface, poly(oligo(ethylene glycol) methacrylate) (pOEGMA) films, which have a great non-biofouling property and chemical functionalizability, were synthesized by surface-initiated, atom transfer radical polymerization (SI-ATRP). Selective immobilization of proteins onto COC was achieved by multi steps from the chemical functionalizability of pOEGMA films. As a model of selective immobilization of proteins, we showed not only micro line patterns of biotin-streptavidin conjugation but also specific bioconjugation between mouse IgG and anti-mouse IgG. Moreover, non-biofouling property and signal to noise (S/N) were improved by both backfilling agent of 1 mM PEG-amine and higher water solvent ratios of OEGMA solution. We also counted the real reaction sites on DSC-activated pOEGMA films by anti-IgG-coated 10 nm Au nanoparticles; DSC-activated pOEGMA films have real reaction sites of about 300 quantities per micro meter square area at least.
1. 바이오 소자인 바이오칩, 마이크로어레이에 사용되는 여러 가지의 생체물질들(ex) DNA, protein, cell)을 사용함에 있어서 생체분자를 효율적으로 검출하기 위해서는 표면에 우리가 원하는 생체 분자간의 특정 결합은 극대화하고, 검출과정에서 생길 수 있는 단백질의 비 특이적인 흡착을 줄이는 것이 바이오 센서분야의 개발 관건이다. 왜냐하면, 이러한 생체물질간의 선택성과 특이성을 바탕으로만 효과적으로 검출할 수 있기 때문에, 표면에 좀 더 효율적으로 이러한 선택성을 높이기 위한 연구가 진행되고 있는 실정이다.
이 실험에서는 thiol 작용기를 가지고 있는 UDT 와 ATRP-initiator 로부터 혼합된 자기조립 단분자막을 금 표면에서부터 형성하여서 표면개시 원자전이 라디칼 중합방법을 이용하여 non-biofouling property 를 가지는 pOEGMA 체인을 형성시킨 후, DSC/DMAP을 사용하여서, activation을 시킨다. Streptavidin을 선택적으로 고정하기 위해, biotin-amine 을 activation 된 고분자 박막에 결합시킨다. 이렇게 형성된 biotinylated pOEGMA 박막을 이용하여서, 고분자 체인 사이의 lateral density 를 조절함으로 타겟 모델인 streptavidin 단백질의 선택적 결합양을 엘립소메트리로 조사하였다. 또한, 고분자 체인 사이의 lateral density 조절에 따른 비 특이적 흡착성을 보기 위해 fibrinogen 과 lysozyme 을 사용하였다. 단백질의 선택적인 결합양이 고분자 체인사이의 lateral density 에 영향은 받지만, 증가하지는 않았다. 또한, 고분자 체인 사이의 거리가 멀어질수록, 단백질의 선택적인 흡착량은 감소하지만 비 특이적 흡착현상은 오히려 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 30 분 이상 고분자 중합반응을 거쳐서 나온 기판들에서는 이러한 lateral density 의 효과가 사라짐을 알 수 있었고, UDT 와 ATRP-initiator 의 비율조절에 상관없이 고분자 박막의 두께가 약 8~10 nm 이상의 biotinylated pOEGMA 박막에서는 streptavidin 의 결합양이 거의 일정해지는 것을 확인하였다. 이런 실험결과로부터 고분자 박막의 두께가 약 8~10 nm 이하에서는 금 표면이 고분자 체인으로 모두 덮이지 못하기 때문에 lateral density 의 효과가 관측되지만, 고분자 박막의 두께가 약 8~10 nm 이상에서는 금 표면이 고분자 체인으로 모두 덮이기 때문에 lateral density 의 효과를 관측할 수 없게 된다라는 가정을 세우게 되었다. 이러한 가정을 확인하기 위해 atomic force microscopy 을 사용하여 두께에 따른 표면에서의 pOEGMA 박막의 형태를 조사한 결과 약 8~10 nm 일 때, 금 표면이 거의 덮이게 된다는 사실을 알 수 있었다.
2. 고리형 올레핀 공중합체 (COC) 는 기계적, 전기적 특성이 뛰어난 고분자로써 그 사용범위가 광범위할 뿐만 아니라, 훌륭한 광학적 성질 때문에 바이오칩의 소자로 응용성이 뛰어나다. 그러나 훌륭한 재료적인 특성을 가지고 있음에도 불구하고, 천연적인 고리형 올레핀 공중합체는 생체 적합적이지 않으므로 고리형 올레핀 공중합체 표면을 생체 적합하게 개질함으로 생물학적인 응용성을 부과할 수 있다.
이 실험은 고리형 올레핀 공중합체 표면을 개질시킴으로 생체물질의 선택적인 고정화를 고리형 올레핀 공중합체 표면에 실현시키는 실험이다. 이렇게 생체물질의 선택적인 고정화를 실현하기 위해 고리형 올레핀 공중합체 표면에 UV 조사를 통하여 Azide-ATRP initiator 를 고리형 올레핀 공중합체 표면에 고정 후, 단백질의 비 특이적 흡착 방지 성질의 고분자인 pOEGMA 을 고리형 올레핀 공중합체 표면에서부터 원자전이 라디칼 중합방법을 통하여 형성시킨다. 형성된 고분자 박막을 이용하여activation 과정을 거친 후, 우리가 원하는 생체물질을 선택적으로 고정화 시킨다. 고리형 올레핀 공중합체 표면에 생체물질의 선택적 고정화를 확인하기 위해 streptavidin line pattern 을 실현시켰으며, 항온 항체 반응인 mouse IgG 와 anti-mouse IgG. 도 선택적으로 고정된다는 것을 형광현미경을 통하여 확인하였다. 또한, mouse IgG 로 고정된 공중합체 표면은 약 300/mm2 개 이상의 실제 반응싸이트가 존재한다.
