Recently, many researchers have been interested in the study of natural building blocks, such as peptides, nucleic acids, phospholipids, for the fabrication of novel bio-inspired materials by self-assembly process, a spontaneous organization of nanoscopic or macroscopic materials into ordered structures. In particular, the formation of amyloid fibrils that consist of mainly beta-sheet secondary structure is one of well-known examples of biomaterials formed through the self-assembly of peptides. The amyloid aggregation in the brain is a hallmark of Alzheimer`s disease, but the precise mechanism leading to the self-assembly of soluble amyloid monomers into insoluble amyloid fibrils has not been resolved yet. Therefore, a rapid and convenient method that enables the high-throughput analysis of environmental conditions affecting the self-assembly of amyloid fibril formation would have a substantial impact. In this thesis study, a microfluidics-based system for the analysis of amyloid fibril formation in vitro has been developed for high-throughput screening, low-consumption of reagents, high sensitivity, and short reaction time. We used insulin and $A\beta$ 42 as model amyloidogenic peptides for amyloid self-assembly and fibril growth within microchannels. Multi-microchannels were immobilized by monomeric amyloid peptides via N-hydroxysuccinimide ester activated and subsequently incubated with factors associated with the formation of amyloid aggregates using a continuous flow injection of fresh amyloid monomer solution. In this work, we investigated (1) temporal evolution of insulin amyloid aggregation within microchannels by using monomeric insulin peptides in the continuous shear flow, (2) high-throughput evaluation of inhibition activity of 12 small molecules known to bind amyloid peptides, and (3) effects of shear flow and metal ions ($Fe^{3+}, Cu^{2+}, Zn^{2+}, Al^{3+}$) on $A\bata$ fibrillogenesis by using ThT-induced fluorescence microscopy and ex situ atomic force microscopy (AFM). The microfluidics-based system will allow the simultaneous analysis of multiple environmental parameters affecting amyloid aggregation and the screening of small molecules inhibitors prior to $it{in vivo}$ evaluation.
최근 많은 연구진들은 핵산과 펩타이드, 그리고 지질과 같은 생체분자들이 자발적으로 정렬된 구조를 갖는 자기조립현상을 이용하여 다양한 분야에서의 응용을 위한 연구를 하고 있다. 특히 나노스캐일의 선형 구조를 갖는 아밀로이드 섬유 (Amyloid fibrils)는 펩타이드의 자기조립 현상을 통해 생성되는 바이오재료로 잘 알려져 있고 생체 내에서 중요한 역할을 한다. 실제로 인슐린으로 만들어진 아밀로이드 섬유는 금속나노선을 만들기 위한 주형으로 쓰이거나 전기전도도를 갖는 폴리머로 코팅되어 나노스케일의 전자소자에도 응용된다. 게다가 베타-아밀로이드 ($\beta$ -amyloid) 펩타이드는 알츠하이머병 같은 퇴행성 신경질환 환자들의 뇌속에서 공통적으로 발견되는 아밀로이드 플라크의 주된 성분이다. 그러나 정상적인 단백질이 다양한 환경 변화에 의해 아밀로이드 형태로 자기조립되는 현상의 원인 및 메커니즘은 현재까지 명확히 밝혀 지지 않았다. 또한 아밀로이드 관련 연구에 사용하는 기존 방법들은 고비용, 고노동강도, 장시간 소모 등의 단점으로 인해 분석 효율이 매우 낮기 때문에 관련 연구에 큰 장애가 되고 있다. 따라서 아밀로이드 자기조립 현상에 영향을 미치는 다중인자에 대한 고효율 분석을 가능하게 하는 방법의 개발이 중요하다. 본 연구에서는, 아밀로이드 자기조립 현상을 다양한 환경조건하에서, 아밀로이드 단량체의 초기자기조립과정부터 아밀로이드 섬유생성까지 $it{in vitro}$ 분석을 할 수 있는 미세유체소자 (Microfluidic device)를 이용한 고효율의 분석 시스템을 개발하였다. 아밀로이드 모델 펩타이드로는 자기조립을 통해 아밀로이드 섬유를 생성 할 수 있는 인슐린과 베타-아밀로이드 ($\beta$ -amyloid) 펩타이드를 사용하여 멀티-미세채널 내에 12개의 아밀로이드 형성 저해제의 효과를 동시에 비교하고 금속이온 ($Fe^{3+}, Al^{3+}, Cu^{2+}, Zn^{2+}$)이 아밀로이드 형성에 끼치는 영향을 관찰하였다. 본 연구 결과에 따르면, 이 시스템은 일반적으로 알려진 벌크상에서의 아밀로이드 생성 시스템과 달리 극소량의 시약으로 번거롭지 않고 빠르게 아밀로이드 조합체를 생성 시키며 짧은 시간 내에 고감도의 동시 분석을 가능하게 한다. 본 연구를 통해 개발한 마이크로플루이딕 기반의 분석 시스템은 다중인자들이 아밀로이드 자기조립현상에 미치는 영향을 효율적으로 분석하고, 복잡하고 오랜 시간이 걸리는 임상 실험 단계이전에 퇴행성신경질환 치료제 후보물질을 스크리닝 할 수 있다.
