Neuron-on-a-chip is a neuron based cell chip providing multichannel electrical signal recording through a microelectrode array (MEA) from live in vitro neurons and it is widely applied in a neuronal network study, a biological processor and a cell-based biosensor. In neuron-on-a-chip technology, there are two big problems: 1) Many MEAs are required for statistical analysis, 2) Neurons migrate from their initial position and it weakens neuron-electrode coupling. In this work, to solve the problems, agarose hydrogel is used as a cell repulsive background material or 3D cell scaffold material. Based on the properties of agarose hydrogel, we developed two kinds of agarose hydrogel based neuron patterning technique and applied them to neuron-on-a-chip technology for solving mentioned problems. 1) independent neuronal circuit array on a chip for high throughput electrophysiological screening, 2) entrapped neuron array for positioning and immobilizing neurons. Independent neuronal circuit array on a chip is capable of measuring electrophysiological signals from tens of independent micro neuronal circuits simultaneously. Agarose hydrogel is fabricated as an array of microwells and it isolates and confines micro neuronal circuits. Recorded extracellular spikes from discrete neuronal circuit array are independent and bursts are asynchronous, so it makes possible obtain tens of data points from single MEA. Entrapped neuron array offers selective patterning of cell body and immobilizing neurons. Neurons are mixed in agarose hydrogel and the neuron/agarose hydrogel is fabricated as an array of micro spots. Neuron entrapped agarose hydrogel cannot move its soma but it freely spreads out its neurite along the cell adhesive protein on MEA surface and forms a neuronal network. These two types of neuron array present a new paradigm for neuron-on-a-chip like high throughput electrophysiological screening systems and in vitro neuronal circuit design capability.
뉴런온칩 기술은 살아있는 동물의 뉴런을 기반으로 하는 세포칩이다. 뉴런온칩은 체외 배양된 뉴런을 수십 개의 마이크로 크기의 미세전극이 집적된 다중미세전극칩에 배양하여 만들어지며, 배양된 뉴런은 다중미세전극칩 상에서 뉴런네트웍을 형성하고, 이 뉴런네트웍이 만들어내는 전기신호를 다중미세전극칩 상의 미세전극을 통하여 측정할 수 있다. 이러한 뉴런온칩은 바이오센서 또는 인공지능 등에 다양하게 활용되고 있다.
현재 뉴런온칩의 활용에 있어서 두 가지 커다란 문제가 존재한다. 첫 번째 문제는 뉴런온칩을 사용하여 신경약물의 효과를 분석하는데 있어 한번의 실험으로 얻을 수 있는 데이터 양이 적어 여러 번의 반복적 실험이 필요하다는 것이며, 두 번째 문제는 초기 뉴런온칩 형성과정 동안 뉴런의 세포체가 지속적으로 다중미세전극칩 상에서 위치를 옮기는 것이다. 본 연구의 목적은 세포의 표면흡착 방해하기도하며 또한 세포를 포착할 수도 있는 성질을 가진 아가로즈 하이드로 겔을 기반으로 하는 새로운 뉴런 패터닝 방법들을 개발하고, 이를 뉴런온칩 기술에 적용하여 위의 두 가지 문제를 해결하는데 있다.
첫 번째 문제의 해결을 위하여 아가로즈 하이드로 겔을 뉴런의 표면 흡착을 방해하는 물질로 사용하는 뉴런 패터닝 기술을 개발하였다. 리소그래피 (lithography)를 이용하여 실리콘 웨이퍼위에 포토레지스트 (photo-resist) 패턴을 형성하고 이를 거푸집으로 하여 PDMS 몰드를 제작한 후, 플라즈마 산화처리하여 몰드 표면을 친수성으로 만들었다. 다중미세전극칩 상에 아가로즈 하이드 겔을 PDMS 몰드와 모세관내 미세몰딩방법 (MIMIC) 을 이용하여 미세전극을 중심으로 하는 100 마이크로미터 지름의 마이크로웰 (microwell) 구조체를 형성하였다. 이 후 다중미세전극칩 위에 랫으로부터 추출한 뉴런을 배양하였다. 아가로즈 하이드로 겔 위에 위치한 뉴런들은 표면에 흡착하지 못해 죽게 되고, 마이크로웰 구조체 안에서만 뉴런들이 자라게 되어, 마이크로웰 내에서 마이크로 신경회로를 형성하였으며, 각 마이크로 신경회로들은 서로 완전히 분리되어 독립된 신경회로를 형성하였다. 마이크로웰 바닥에 위치한 미세전극을 통해 마이크로 신경회로로부터 전기신호를 측정 할 수 있었으며, 사용한 다중미세전극칩은 총 59개의 미세전극으로 구성되어 있어 최대 59개의 독립된 마이크로 신경회로로부터 동시에 신호를 측정 할 수 있게끔 하였다. 이러한 아가로즈 하이드로 겔을 기반으로 하여 제작된 다중미세전극칩의 독립된 신경회로 어레이를 이용할 경우 하나의 다중미세전극칩을 이용한 한번의 실험으로 수십 개의 독립된 신경약물 반응 데이터를 얻을 수 있음을 실험을 통하여 확인하였다.
두 번째 문제의 해결을 위해서는 아가로즈 하이드로 겔에 뉴런을 섞어 패터닝하는 뉴런 패터닝 기술을 개발하였다. 아가로즈 하이드로 겔에 포착된 뉴런은 그 위치가 변하지 않고 고정된다는 점에 착안하여, 랫에서 추출한 뉴런을 아가로즈 용액에 섞고, 이를 PDMS 마이크로 스텐실 (micro stencil)을 이용하여 세포 배양 기판에 패터닝하였다. PDMS 마이크로 스텐실은 리소그래피를 통해 제작된 실리콘 웨이퍼 상의 포토리지스트 위에 PDMS를 스핀 코팅하여 제작하였다. 제작된 PDMS 마이크로 스텐실은 높이 37 마이크로, 지름 105 마이크로의 미세 구멍들을 갖고 있다. PDMS 마이크로 스텐실을 이용하여 아가로즈 하이드로 겔을 마이크로 배열 구조로 패터닝하는 과정을 통해 아가로즈에 포착된 뉴런들도 세포 배양 기판 위에 마이크로 배열을 형성하였다. 형성된 아가로즈 하이드로 겔은 지름 108 마이크로, 높이 38 마이크로의 기둥형 구조체이며, 내부에 뉴런들을 포착하고 있다. 아가로즈 내부에 포착된 뉴런들로부터 일반적인 뉴런컬쳐와 동일한 길이의 신경다발들이 아가로즈 하이드로 겔을 뚫고 나와 자유롭게 성장해 나왔으며, 배양 기간 동안 세포체의 위치는 고정되었다. 또한 이 뉴런 패터닝 방법을 통하여 다중미세전극칩 상의 미세 전극 위에 뉴런을 위치 시키는 것도 가능함을 확인하였다. 아가로즈 하이드로 겔에 포착시켜 패터닝하는 방법은 세포 배양 기판 상에 뉴런을 패터닝 함에 있어 세포체의 위치를 고정하면서 신경다발의 성장은 제어 하지 않으므로, 뉴런 패터닝에 있어서 세포체 패터닝과 신경다발 패터닝을 분리시킬 수 있어 보다 정확한 구조의 신경 네트웍 형성이 가능 하리라고 판단된다.
본 연구를 통하여 아가로즈 하이드로겔을 기반으로 하는 2 가지 뉴런 패터닝을 개발하고, 이 방법들을 통하여 다중미세전극칩 상에 뉴런을 패터닝함으로써 뉴런온칩 기술에 응용하였다. 첫째로 아가로즈 하이드로 겔을 뉴런 표면 흡착 방해 물질로 사용한 뉴런 패터닝 기술을 통하여, 다중미세전극칩의 각 전극과 결합된 독립된 마이크로 뉴런회로망 배열을 제작하였다. 둘째로 아가로즈 하이드로 겔에 뉴런을 섞어 마이크로 몰딩하는 뉴런 패터닝 기술을 통하여, 신경세포체의 위치가 고정된 신경 네트웍을 형성하였다. 위의 두 뉴런 패터닝 방법은 다중미세전극칩 상에서 미세전극 위에 뉴런을 위치시키는데 우수한 효과를 보였다. 또한 각 패터닝 방법은 뉴런온칩 기술들은 각각 제약산업과 신경생리학 연구를 위한 high throughput 전기생리 분석도구로 발전 시킬 수 있는 가능성을 제시하였으며, 또한 뉴런 패터닝에 있어서 신경다발 패터닝으로부터 세포체 패터닝을 독립 시키는 뉴런 패터닝의 새로운 패러다임을 제시하였다.
