We report here an enzyme-amplified, sandwich-type immunosensor for detecting the biospecific interaction between an antibody and antigen using an electrocatalytic reaction. We employed biotin/anti-biotin IgG as a model immunosensing pair. Partially ferrocenyl-tethered dendrimer (Fc-D), whose ferrocene moiety acts as an electrocatalyst, was immobilized to the electrode surface by covalently binding between the dendrimer amines and the carboxylic acids of a self-assembled monolayer. The unreacted amines of the immobilized Fc-D were modified with biotin groups to allow the specific binding of goat anti-biotin IgG. Rabbit anti-goat IgG-conjugated alkaline phosphatase was bound to goat anti-biotin IgG to catalyze conversion of p-aminophenyl phosphate monohydrate to p-aminophenol. This product is oxidizedto quinoimide by the reduction of ferrocenium back to ferrocene, producing an electrocatalytic anodic current.Cyclic voltammograms and surface plasmon resonance experiments showed that the binding of nonspecific proteins is not significant on the biotinylated Fc-D surface. We also examined the change in peak current according to the concentration of anti-biotin IgG and found that the detection range of this immunosensing scheme is between 0.1 and 30 μg/mL.
Signal amplification is the most important strategy in lowering detection limits of immunosensors, and labels that can generate many signaling molecules per biospecifically bound target have been widely used.To achieve higher signal amplification in electrochemical immunosensors, the enzymatic amplification step has been combined with a further amplification step, like the redox cycling of enzymatically amplified electroactive species. Redox cycling of enzymatically amplified electroactive species has been widely employed for high signal amplification in electrochemical biosensors. However, gold (Au) electrodes are not generally suitable for redox cycling using a reducing (or oxidizing) agent because of the high background current caused by the redox reaction of the agent at highly electrocatalytic Au electrodes.
Here we report a new redox cycling scheme, using nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), which can be applied to Au electrodes. In sandwich-type electrochemical immunosensors for mouse immunoglobulin G (IgG), an alkaline phosphatase label converts p-aminophenyl phosphate into electroactive AP. The amplified AP is oxidized to p-quinone imine (QI) by electrochemically generated ferrocenium ion. NADH reduces QI back to AP, which can be reoxidized. This redox cycling enables a low detection limit for mouse IgG (1 pg/mL) to be obtained.
We also investigate the biosensor using enzymatic synthesised polypyrrole. Polypyrrole could be synthesied by the products of enzyme lable of biosensor. It is colorful and conductive so we can detect dual methods, optical and electrochemical. Another advantage is that polypyrrole is nontoxic and stable in vivo. We had polypyrrole precipitaion in the present of HRP enzyme, hydrogen peroxide, polyanionic template, and pyrrole monomer. We characterize it with cyclovoltammogram and FT-IR.
최근 의학과 생화학 분야에서는 종전의 분석법보다 더 감도가 좋으며, 대량의 정보를 한 번에 간단하게 처리할 수 있는 칩 기반의 바이오센서에 대한 연구가 매우 활발하다. 이러한 최근의 흐름에 발맞추어 본 연구에서는 항원-항체 사이의 상호 특이적인 인식을 전기화학적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 연구를 수행하였다.
금 전극위에 유기분자인 Mercaptododecanoic acid(MDA), Mercaptoundecanol(MUO)를 이용해서 자기 조립 단분자층을 형성하고, 이 위에 부분적으로 페로센 치환된 덴드리머(dendrimer)를 EDC/NHS coupling을 이용하여 공유결합 시켰다. 유기분자의 자기조립단분자막으로 표면 개질된 금 전극은 바이오분자를 고정하기 위한 플랫폼으로서 많이 사용되는데, 여기서는 페로센 치환된 덴드리머를 도입함으로서 전기화학 반응에 대한 전자전달의 매개체의 역할도 가능하게 하였다. 그 후에 항원인 biotin을 공유결합을 이용하여 (EDC/NHS coupling) 덴드리머 위에 고정시키면 항체를 검출할 수 있는 전극이 완성된다. 항원을 인식할 수 있는 항체가 시료 중에 존재하게 되면 전극표면의 항원을 인식하게 되고, 또 다시 이 항체를 인식할 수 있는 효소( Alkaline phosphatase(ALP))가 표지된 두 번째 항체를 넣어서 항원과 항체사이에 상호특이적인 인식을 검출 하도록 하였다.
항원 항체 특이적인 반응의 인식은 ALP를 표지로 한 전기화학적 방법으로 측정될 수 있다. ALP는 p-Aminophenol phosphate (p-APP)라는 효소의 기질을 효소반응을 통해서 p-Aminophenol (p-AP)라는 산화 환원 반응이 가능한 물질로 변화시킨다. 이 물질은 표면 개질된 전극에 있는 페로센에 전자를 전달하여 전기촉매 전류가 흐르게 한다.
산화 환원 측정 순환 전압전류법 (CV)과 Surface Plasmon Resonance (SPR)로 측정한 결과 항체가 없거나, 항체를 다른 종류의 항체로 대체 했을 경우에는 전기촉매 전류가 흐르지 않았다. 각각의 경우에 비특이적 결합은 매우 작았으며 이는 항원 항체가 상호특이적으로만 결합한다는 것을 보여준다.
또한 정량적인 실험결과 약 0.1 μg/mL 에서 30 μg/mL에의 농도의 항체를 정량적으로 검출 할 수 있었다. 이 방법의 측정 감도가 매우 좋다는 것을 보여준다.
chapter 2 에서는 앞서 설명한 전기화학적 항원항체 센서의 감도를 보다 높이기 위해 신호를 증폭할 수 있는 방법에 대해 연구하였다. 센서의 감도를 논높이기 위해서는 신호대 잡음비를 증가시켜야 하는데, 먼저 배경전류(background current)를 줄이기 위하여 페로센 치환된 덴드리머의 페로센 비율을 약 30%에서 약 0.5%로 줄였다. 이는 전자전달능력은 크게 변화없으면서 배경전류는 많이 줄어들게 되어 신호대 잡음비를 증가시키는 효과가 있다. 또한 효소반응결과 생겨난 p-AP가 페로센에 전자를 전달한 후 Quinone imine (QI) 으로 변하게 되는데, nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)를 통한 redox cycling을 이용해서 QI를 다시 p-AP로 환원 시킴으로서 신호를 증폭시켜서 약 1 pg/mL 농도의 타켓 항체까지 검출이 가능함을 보였다.
chapter 3 에서는 효소반응의 반응물로서 전기화학특성을 갖는 분자가 아닌 전기전도성고분자를 이용하여 바이오센서를 제작하였다. 폴리피롤은 전기전도성을 갖는 검은색의 고분자 물질로서 Horseradish peroxidase (HRP) 라는 효소를 이용하여 효소반응으로 합성이 가능하다. 따라서 항체나 바이오센서의 표지로서 HRP를 사용하게 되면, HRP 가 과산화수소와 음이온성 template 존재하에서 폴리피롤을 합성하게 된다. 이렇게 합성되어 전극위에 침전된 폴리피롤은 그 전기전도성 특성으로 인해 전기화학적으로 측정이 가능하고, 색깔을 띠기 때문에 광학적으로도 측정이 가능하다.
이러한 새로운 항원 항체 인식에 대한 전기화학적 측정법은 앞으로 biotechnology분야에서 크게 이용될 것이다.
