We report the new method for detection of DNA hybridization using enzymatic cleavage. The strategy is based on thst S1 nuclease is able to specifically cleave only single strand DNA, but not double strand DNA. The capture probe DNA thiolated single strand DNA labeled with eletroactive ferrocene group, was immobilized on a gold electrode. After hybridization of target DNA of complementary and noncomplementary sequences, nonhybridized single strand DNA was cleaved using S1 nuclease. The difference of enzymatic cleavage on the modified gold electrode was characterized by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry. We successfully applied this method to the sequence-selective discrimination between perfectly matched and mismatched target DNA including a single-base mismatched target DNA. Our method does not require eigher hybridization indicators or other exogenous signaling molecules which most of the electrochemical hybridization detection systems require.
The ability to pattern a selective surface with different molecules has importance for molecular electronics and biotechnology applications, as well as for nanoengineering. For this, the patterning of many kinds of biomolecules as probes on the same solid surface is essentially required. Therefore, many research efforts have been focused on the thin film technology including self-assembly method. Most popular method to attach the various biomolecules on surfaces is to form the activating ester by EDC/NHS coulping reaction with carboxylic acid terminated surfaces. However, this method is time-consuming and has drawbacks in selective patterning. We have developed a new electrochemical method to pattern many biomolecules. This is based on electrochemically-induced and site-selective NHS patterning on self-assembled monolayer for subsequent covalent binding of biomolecules. We have studied potential-induced binding of different sequence DNA on microarrayed electrodes and characterized the modified surface with surface plasmon resonance(SPR), surface IR and SEM experiments.
효소에 의한 쪼개짐을 이용하여 DNA hybridization의 검출을 위해 새로운 방법을 개발하였다. 이 방법은 S1 nuclease가 이중가닥 DNA는 자르지 못하고 단일가닥 DNA만 자르는 특이성을 기초로 한다. 금 전극 위에 전기적 활성인 Ferrocene 과 함께 Thiol이 결합된 단일가닥 DNA인 capture probe DNA를 고정화한다. 상보적 혹은 비상보적인 target DNA의 hybridization 과정 후에 S1 nuckease를 이용하여 nonhybridized 단일가닥 DNA를 자른다. 변화된 금 전극 위에 효소에 의한 쪼깨짐의 차이는 순환전압전류법 ( cyclic voltammetry, CV )과 펄스 차이 전압전류법 ( differential pulse voltammetry, DPV )에 이용해 관찰하였다. 한 개의 base가 어긋난 target DNA를 포함하여 어긋난 target DNA와 완전히 일치하는 DNA의 선택적 서열 구분을 이루어 냈다. 이 방법은 대부분의 전기화학적 hybridization 검출에서 요구하는 hybridization 표식이나 다른 외적인 신호가 나오는 분자가 필요 없이도 수행 할 수 있는 장점이 있다.
다른 분자를 표면에 선택적으로 patterngk는 방법은 분자 전자 공학이나 생물 공학등에 중요하다. 이를 위해 같은 표면에 다양한 생분자를 patterning하는 방법은 꼭 필요하다. 특히 자기박막조립 표면( self-assembled monolayer )에 다양한 분자들을 고정시키기 위해 기존에 많이 사용하는 전극표면 활성방법 중에 하나가 EDC/NHS coupling을 통하여 활성 에스터를 형성하는 것이다. 하지만 이 방법은 전극을 시간적인 한계가 있으며, site-selectivity에 문제점을 지니고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 전기화학을 이용하여 EDC와 커플링 없이 직접 NHS를 금 전극 위에서 빠르게 반응시켜 전극활성화 시키는 방법을 연구하였다. 기본적인 메카니즘은 금 전극에 self-assembled monolayer 형태로 하이드로 퀴논을 고정시킨 다음 전기화학적 산화를 통하여 퀴논형태로 전환시키면 퀴논 자체가 좋은 이탈기(leaving group)를 형성함로서 NHS와 퀴논의 친핵적 아실 치환반응을 수반하는 것이다. 이렇게 하여 얻어진 NHS 말단기는 아민을 수반하는 다양한 분자 및 생분자와의 특이반응에 사용될 수 있다. 이번 실험의 특징은 원하는 전극에만 선택적으로 NHS를 반응시켜 전극을 활성화 할 수 있다는 장점이 있으며, 기존의 EDC/NHS coupling은 2시간 이상이라는 장시간이 소요되는 반면, 수초 내에 NHS 말단기를 형성 할 수 있다는 장점이 있다. 이처럼 전기화학적 방법을 통하여 자리 선택적 ( site-selective )으로 형성한 NHS말단기와 다양한 분자 및 생분자와의 반응특이성을 살펴보았다. 이러한 NHS 말단기에 amine이 modified된 DNA를 고정시키는 실험 및 여러 개의 금 배열 전극에 선택적으로 nanoparticle 고정 및 nanotube의 covalent attachment를 통한 bridge 형성실험을 연구하였다. SPR, IR 분광법, SEM을 이용하여 다른 서열의 DNA가 선택적으로 고정화된 전극을 관찰하였다.
