Insulin-like growth factor 1 (IGF1) is a well-known therapeutic protein and highly homologous to proinsulin in three dimensional structure. A truncated IGF1 containing 70 amino acids from $Gly_{33}$ to $Ala_{102}$ was expressed in recombinant Escherichia coli. IGF1 was fused with the 6 lysine tag and ubiquitin at its N-terminal (K6Ub-IGF1) for soluble expression and easy purification. Fed-batch fermentation of E. coli TG1 containing the IGF1 expression system pAPT-K6Ub-IGF1 resulted in 60.8 g/L cell density and 18% K6Ub-IGF1 content relative to total protein. The fusion protein was mainly expressed as form of insoluble inclusion bodies with IPTG induction. High accumulation of K6Ub-IGF1 as inclusion body required efficient and economic refolding processes.
The conditions of refolding were optimized through the dilution methods. At the optimal refolding condition of 50 mM bicine buffer (pH 8.5) containing 125 mM L-arginine and 0.25 mM L-cysteine, 240 mg/L of denatured K6Ub-IGF1 was refolded by 33% yield. Simple dilution refolding under the optimized condition, affinity chromatographic purification and site-specific UBP1 cleavage led to 97% of purity and 18.2% of total IGF1 purification yield based on the amount of inclusion body initially added. It was also found that the addition of L-arginine prevented self-aggregation of K6Ub-IGF1 and hence improved final refolding yield. The renaturation efficiency of the reduced IGF-I into the native conformation was greatly increased in the presence of 125mM L-arginine in 50mM bicine buffer, pH 8.5. The refolded fusion protein was selectively cleaved with UBP at the linkage site, without the degradation by peptidases derived from the host cell. The released IGF-I was purified using cation-exchange chromatography and reversed phase HPLC to give recombinant IGF-I of more than 97% purity.
The optimized conditions of refolding and cleavage reactions were applid to the on-coumn process of cation exchange chromatography. The nascent IGF1 was also obtained through solid-phase refolding and on-column cleavage by UBP1 with a little higher yield. The refolding yield was more increased upto 25.7 mg IGF from 10g wet cell when sulfonation step was linked to the on-column refolding process.
Oleosin-fused IGF1 was expressed in the insoluble form of aggregates in Escherichia coli. The stability of artificial oil body (AOB) emulsions constituted with soybean oleosin was maximized in the optimal conditions of triacylglyceride (96.6 %, wt/wt), phospholid (1.13 %, wt/wt), and oleosinUbIGF1 (1.81%, wt/wt). When AOB were resuspended in a dilute buffer at pH 7.5 and 24°C, the suspension remained quite stable for the first 24 h. It was assumed that OleUbIGF1 embeded on the surface of AOBs underwent self-refolding. As a result, the amount of the correct folded IGF1 on AOB, cleavaged afterward, was higher than in the crude cell extract. The result suggests that oleosin provides a repulsive force to prevent unfolded polypeptides from contacting, thereby ensuring their efficient refolding.
Insulin-like growth factor 1 (IGF1)는 잘 알려진 치료용 단백질이며 Proinsulin의 3차 구조와 매우 흡사하다. 긴 부분을 잘라낸 IGF1는 아미노산 $Gly_{33}$ 부터 $Ala_{102}$ 까지의 70개 아미노산으로 구성되어 있으며 재조합 대장균에서 발현되었다. 수용성의 발현과 편리한 정제를 위하여 IGF1는 그 N-terminal 에 6개의 lysine tag 와 ubiquitin 를 붙여서 K6Ub-IGF1로 융합되었다. IGF1 발현 시스템인 pAPT-K6Ub-IGF1 벡터를 포함하는 E. coli TG1을 Fed-batch 발효시키면 60.8 g/L의 세포 농도로 성장하였으며 총 단백질 대비 18%의 함량으로 K6Ub-IGF1 을 발현하였다. 이 융합단백질은 IPTG induction 과 함께 주로 불용성의 내포체의 형태로 발현하였다. K6Ub-IGF1 가 불용성 내포체로 축적함에 따라 효율적이고 경제적인 재접힘 공정을 개발할 필요가 있었다.
재접힘의 조건들은 희석에 의한 방법을 통하여 최적화되었다. 125 mM L-arginine 와 0.25 mM L-cysteine를 포함하는 50 mM bicine buffer (pH 8.5)가 최적의 재접힘 조건으로 결정되었으며 이로부터 240 mg/L 의 denatured K6Ub-IGF1 가 33%의 효율로 재접힘되었다. 최적 조건하에서 단순한 희석에 의한 재접힘을 실시하고 절단 효소인 site-specific UBP1으로 융합단백질을 절단한 후에 affinity chromatographic purification 으로 간단히 정제함으로써 97%의 순도를 가지는 IGF1를 생산할 수 있었으며 이것은 초기에 투입된 K6Ub-IGF1 의 내포체의 양을 기준으로 총 18.2% 의 정제 수율을 나타내었다. 또한 L-arginine 의 첨가가 K6Ub-IGF1 의 self-aggregation 를 방지하였고 따라서 최종 재접힘 수율을 더욱 향상시켰다. 환원된 IGF1 를 native conformation 의 IGF1 로 재접힘시키는 효율은 50mM bicine buffer, pH 8.5에서 125mM L-arginine 의 조건에서 크게 향상되었다. 재접힘된 융합단백질은 host 세포로부터 유래한 peptidase에 의하여 분해되지 않고 연결부위에서 UBP1에 의하여 선택적으로 절단되었다.
절단된 IGF1 는 양이온 교환 수지를 이용하는 크로마토그래피와 역상 HPLC 에 의하여 97% 이상의 순도로 정제하였다.
재접힘과 절단반응의 최적화된 조건들을 양이온 교환수지를 이용하는 크로마토그래피에 적용함으로써 on-coumn 공정을 구축하였다. nascent IGF1는 고체상 재접힘과 절단 반응에 의하여 좀더 높은 수율로 획득할 수 있었다. 재접힘 수율은 on-coumn 공정에 설폰화 반응을 추가함으로써 더욱 높아졌는데 10g 의 wet cell 로부터 약 25.7 mg 의 IGF1 를 얻을 수 있었다.
Oleosin 과 융합된 IGF1는 재조합 대장균에서 불용성의 내포체 형태로 발현되었다. 이 내포체를 재접힘시키기 위하여 먼저 artificial oil body (AOB)의 에멀젼을 만들고 그 안정성을 시험하였다. emulsions constituted with soybean oleosin으로 구성된 오일바디는 triacylglyceride (96.6 %, wt/wt), phospholid (1.13 %, wt/wt), oleosinUbIGF1 (1.81%, wt/wt) 의 최적조건에서 최대로 안정하였다. artificial oil body (AOB)를 24°C 와 pH 7.5 조건을 가진 희석된 버퍼속에서 현탁시켰을 때 최소 24시간 동안 안정하였다. artificial oil body (AOB)의 표면에 잠겨있는 OleUbIGF1 는 자가 재접힘을 통하여 재접힘되며 그 결과 AOB의 표면에 잠겨있는 OleUbIGF1의 재접힘 효율은 세포 파쇄액상의 OleUbIGF1 의 재접힘 효율보다 높았다. 이러한 AOB상에서 융합단백질 내의 oleosin은 unfolded polypeptides 간의 접촉을 방해함으로써 스스로 효율적으로 재접힘할 수 있었다.
