In this study, to improve the sensitivity of MR up to the level where detection of molecular markers becomes possible, Magnetite Encapsulated Polymeric Nanocomposite (MEPN) have been developed. In the first part of this work, magnetite nanocrystals were synthesized by the growth-controlled coprecipitation technique of ferric aqueous solution at the room temperature. The size of nanocrystals was controlled in the range from 6 to 12 nm when picoliter droplets were used. On the basis of growth-controlled coprecipitation mechanism, growth-dominant coprecipitation using microjet technique was developed. Prepared nanocrystal shows superior magnetic property that can be used as ultrasensitive MR contrast agent for further experiments.
At the second part of this work, nanocapsules containing magnetite nanoparticles were prepared by emulsification-diffusion technique and the effects of homogenization and agitation speed on the size of the nanoparticles were observed. The factor dominating the size was the homogenization strength and optimal polymer concentration. The encapsulation efficiency was precisely controlled by the ratio between magnetite and PLGA with the support of co-solvent. The magnetic properties of MEPNs were also measured. There was no size effect of magnetite in encapsulation, because the ZFC curve shows similar behavior with same blocking temperature. And the local condensation of magnetite nanoparticles due to the hydrophobic capping ligand finally leads to the separation of small amount of highly-capsuled particles and large amount of magnetite-free particles. The magnetic relaxation was finally performed for the evaluation as MRI contrast agent. The aggregation of magnetite nanoparticles gives enhanced relaxation ability to the PLGA nanoparticles over intrinsic relaxivity.
For the last part of this study, antibody-conjugated MEPNs were prepared. Herceptin was effectively conjugated with MEPNs through EDC-mediated reaction. MEPNs showed no cytotoxicity toward any cell lines even at relatively high concentrations. In vitro cancer detection sensitivity was studied and the MR signal enhancement for the MCF-7 cell line treated with 0.75 μg Fe/ml HER-MEPN conjugates was lower (~233%) than NIH3T6.7 cell line treated (~246%) with 0.25 μg Fe/ml HER-MEPN conjugates due to the difference in HER2/neu expression level.
Finally, in vivo imaging of small-sized tumors (~50 mg) was investigate. The observed R2 enhancements were 23%, 15%, 35%, 37%, and 68% for postinjection, 1 h, 3 h, 5 h, and 24 h after the injection, respectively. This indicates that the tumor site was effectively covered with HER-MEPNs, and it also shows the long-circulating ability of the particles within blood stream. These results imply that the HER-MEPNs are promising MR probes to make early cancer detection possible.
해상력은 뛰어나지만 측정감도는 비교적 낮은 MRI의 한계를 뛰어 넘어 종양의 조기진단을 가능케 하기 위해 이완성을 향상시킨 산화철이 포집된 고분자 복합체(MEPN 입자)가 개발되었다.
첫째로, 수용액 상에서 입자성장의 조절이 가능한 마그네타이트 자성나노입자를 화학적 공침법으로 제조하였다. 마이크로젯을 통해 분사된 반응용액은 피코리터 단위로 알칼리 용액속으로 적하되었으며, 각각의 액적을 나노입자가 합성되는 마이크로 반응기로 생각하여 반응메커니즘을 연구하였다. 합성된 나노입자의 평균 크기는 마이크로젯을 이용했을 때는 6 에서 12 nm 까지 조절되었으나, 피펫을 이용한 적하법에서는 동일한 조건에서도 9 nm 크기의 입자만을 얻을 수 있었다. 합성된 산화철의 크기는 TEM과 XRD를 통해 분석하였고, 라만 분광분석법과 XRD의 비교 분석을 통해 합성된 산화철이 마그네타이트임을 확인하였다. 또한 SQUID를 이용하여 측정한 입자의 자성과 ZFC 그래프는 합성된 산화철이 실온에서 초상자성 거동을 보인다는 것을 보였고, 입자의 평균 크기가 커짐에 따라 나노입자의 Blocking 온도도 증가함을 증명하였다.
화학적 공침법에서 새로이 발견한 반응메커니즘을 이용하여 결정핵 생성 과정과 입자 성장 과정을 분리시킨 ‘입자성장이 우세한 화학적 공침법’을 개발하였다. 마이크로젯을 통해 알칼리 용액을 과량의 반응용액 속으로 천천히 분사하여 반응 초기에는 결정핵 생성과정이 우세한 반응이 일어나며, 결정핵 생성 종료 후에는 입자성장이 일어나도록 조절할 수 있었다. 이 방법으로 평균 크기가 9, 14, 48 nm 인 자성입자를 합성하였으며, 입자크기의 분포도를 획기적으로 줄여 MRI에 민감성이 훨씬 뛰어난 입자를 합성할 수 있었다.
다음으로, 유화-확산법을 이용하여 산화철을 캡슐화시킨 자성 나노 스피어 (MEPN)를 제조하였다. MEPN의 크기 및 크기 분포는 유화 단계에서의 균질기의 속도와 확산단계에서의 교반속도의 변화를 이용하여 100 nm 에서 300 nm 까지 쉽게 조절이 가능하였다. 또한, 기존 유화-확산법에서 문제점으로 지적되던 낮은 캡슐화 효율을 공용매의 적용과 산화철 코팅물질의 변화 등을 이용하여 크게 증가시켰다. SQUID를 통해 분석한 자성과 ZFC 그래프에서 캡슐화 과정 중에 자성나노입자의 크기에 대한 영향이 거의 없다는 것을 확인할 수 있었으며, TEM 분석을 통해 PLGA보다 소수성이 큰 산화철이 액적 내에서 편재되어 존재함에 따라 산화철 함량이 높은 입자들과 산화철이 포집되지 않은 입자들로 크게 나뉘어 캡슐화되는 메커니즘을 발견하였다.
MEPN의 MR 조영제로서의 사용 가능성을 판단하기 위하여 T1, T2 이완성 실험도 수행되었다. MEPN의 산화철 함량이 증가함에 따라 산화철의 편재화 비율이 증가하게 되며, 이는 입자 주위의 양성자들이 산화철 입자 주변으로 접근할 수 있는 가능성을 크게 차단하므로, 스핀과 주변의 물질사이의 에너지 전달을 기반으로 하는 입자의 T1 relaxivity (R1) 를 크게 감소시켰다. 반면, 스핀과 스핀 사이의 상호작용을 기반으로 하는 T2 relaxivity는 산화철의 캡슐화 효율이 증가함에 따라 오히려 약간 증가하는 경향을 보였다. 이는 산화철 입자들이 MEPN 내에서 집합체로 존재함에 따라 스핀의 상호작용에 추가적인 영향을 미치는 집합체 효과 (Aggregation effect) 때문이며, 이는 MEPN의 조영제로서의 사용가능성을 크게 증가시켜 주었다.
MEPN 입자에 표적화 능력을 부여하기 위하여 항체를 결합시킨 HER-MEPN 입자를 개발하였다. 종양을 표적화할 수 있는 허셉틴을 수용액 상에서 EDC 링커를 사용하여 HER-MEPN 입자 표면의 카르복실기에 부착하였으며, 합성된 입자는 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 허셉틴의 표적항원인 Her-2/neu receptor의 발현비율에 차이가 나는 MCF-7 세포 와 NIH3T6.7 세포를 이용하여 HER-MEPN의 생체 외 (in vitro) 세포실험을 FACS와 MRI를 통해 진행하였다. Her-2/neu의 발현비율이 낮은 MCF-7 세포는 NIH3T6.7 세포보다 세 배의 HER-MEPN을 처리하여도 조영효과가 더 낮은 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 합성된 조영제의 우수한 표적지향성을 보여주는 결과이다.
마지막으로, 작은 크기의 종양(~50 mg)을 탐지할 수 있는가에 대한 HER-MEPN 입자의 생체 내 (in vivo) 실험을 수행하였다. 표적지향성을 부여한 HER-MEPN 입자와 이의 대조군으로서 표적지향성이 없는 항체인 Immunoglobulin G (IgG)를 부착한 IGG-MEPN 입자를 마우스에 주사하여 생체 내 조영효과를 살펴보았다. HER-MEPN 입자를 주사한 마우스는 시간이 지남에 따라 점차적으로 종양부위의 T2 시그널이 감소하여 24시간 뒤에는 68%까지 크게 감소하는 것을 볼 수 있었으며, IGG-MEPN 입자를 주사한 마우스는 시간에 따라 종양부위의 T2 시그널에 큰 변화가 없다가 ERP 효과에 의하여 24시간 뒤에 혈관 주변부에 침착되는 현상을 관찰할 수 있었다. 이는 HER-MEPN 입자의 뛰어난 MR 조영효과과 우수한 표적지향성을 증명하는 결과이다.
