Electrochemical method has been a good analytical technique for a miniaturized and portable biosensor, contributing to an achievement of point-of-care testing (POCT) or disease diagnosis. Particularly, due to the fact that it does not require any complicated equipment and it generates numerical signal without computational data analysis, rapid, simple and cost-effective detection could be achieved with electrochemistry. In this study, the electrochemical detection methods for the genetic diagnosis including Korean-specific breast cancer and sexually transmitted diseases were described.
A new electrochemical detection method of DNA mutation on a gold electrode surface was developed utilizing mismatch-specific DNA cleavage and amplified electrocatalytic signaling. After target samples were hybridized with biotin-modified capture probes immobilized on the electrode, the hybridized double-stranded DNA (dsDNA) was treated with Surveyor™ nuclease. With subsequent addition of glucose oxidase (GOX)-avidin conjugate, electrocatalytic current was generated when the dsDNA was perfectly matched. Successive addition of biotin-modified polyamidoamime dendrimer (generation 4) caused densely assembled GOX on the electrode surface generating highly enhanced electrocatalytic current. On the other hand, there was no significant electrocatalytic current observed when the dsDNA contained base-mismatched site because it was cleaved by the nuclease and removed from the electrode including biotin tag.
Using the method described above, we could successfully detect the insertion, deletion, and displacement of single base in real BRCA1 gene samples, and the results exhibited highly selective detection of DNA mutation on the electrode surface.
We also detected gene of STD pathogen, Chlamydia trachomatis, using artificially designed capture probe having base-mismatched site when it was hybridized with target strand. As a result, we could successfully detect the target PCR product from real patients in detection limit of nano-molar scale which is enough limit of detection in the PCR-based genetic diagnosis.
From the results achieved, this electrochemical method for the detection of DNA would be widely used as a powerful detection method for genetic diagnosis field.
바이오센서 분야에서 전기화학적인 방법은 장비의 소형화가 가장 용이한 방법 중 하나로서, 간편하고 경제적인 질병 진단을 가능케 할 수 있는 유망한 분석 방법이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 핵산내부절단 효소와 당산화효소를 전기화학적 분석방법에 적용하여, 유전자 변이에 의한 유방암의 진단과 클라미디아 병원균에 의해 감염되는 성병의 진단을 수행하였다.
새롭게 고안된 분석 방법은 목적 유전자와 상보적인 가닥을 합성하여 5’ 끝에 바이오틴 그룹을 붙여주고, 합성된 단일 가닥을 금 전극 표면에 고정화 하는 것을 시작으로 한다. 전극 위에 분석을 원하는 목적 유전자를 반응시킨 다음에 핵산내부절단효소중의 하나인 서베이어 뉴클레이즈를 반응시킨다. 이때 전극 위에서 혼성화된 핵산에 염기짝이 서로 맞지 않는 부분이 있으면 이 효소는 그 부분을 절단하게 된다. 따라서 5’ 끝에 존재하던 바이오틴 그룹도 전극 세척 과정을 거치면서 전극 표면 위에서 제거되게 된다. 다음 단계로 아비딘이 결합된 당산화효소를 전극 표면에 반응 시키면, 바이오틴 그룹이 남아 있을 경우에는 당산화효소가 전극 표면에 붙게 되고, 그렇지 않을 경우에는 반응이 일어나지 않게 된다. 반응이 끝난 전극을 당산화 효소의 기질인 글루코스와 전자전달물질인 페로센분자를 함유하고 있는 전해질 조건에서 분석을 하면 당산화효소로부터 생성되는 촉매적인 전류신호를 볼 수 있다. 신호의 증폭을 위해 아민 그룹의 일부가 바이오틴 그룹으로 치환된 덴드라이머 고분자를 추가적으로 반응 시키면 전극 표면에 바이오틴 그룹이 있을 때, 즉 분석 시료에 있는 핵산에 돌연변이가 없을 때, 전극 표면의 당산화효소의 농도가 높아지게 되고, 따라서 월등히 향상된 전류 신호를 얻을 수 있었다.
이와 같은 방법을 이용하여 실제 유방암을 유발한다고 알려진 돌연변이가 발생한 실제 환자들로부터 얻은 유전자 시료를 분석하였다. 실험 대상으로 단일 염기가 없어진 경우, 다른 염기로 치환된 경우, 단일 염기가 더 생긴 경우, 세 가지 종류의 돌연변이에 대하여 분석을 진행한 결과 세 경우 모두에 대하여 돌연변이가 발생한 시료와 그렇지 않은 정상 시료의 구분이 충분한 신호의 세기로 가능하였다.
성병 유발 병원균인 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위해서, 병원균에 상보적인 가닥에 인위적으로 한 개의 염기 서열을 다른 염기로 치환하여 전극에 고정화 하였다. 마찬가지 분석 방법을 사용하여 약 나노몰 농도의 클라미디아 병원균의 유전자를 성공적으로 검출 할 수 있었는데, 이 검출한계는 중합효소연쇄반응을 동반한 분석 방법에 충분히 적용할 수 있는 검출 한계이다.
본 연구는 기존의 전문적이고 고가의 실험장비를 필요로 하는 분석방법에서 사용했던 효소인 서베이어 뉴클레이즈를 전기화학적인 분석 방법에 최초로 적용하여 실제 질병 유전자를 성공적으로 검출함으로써, 향후 유전병 또는 전염병 등의 조기 진단 및 조기 치료를 위한 빠르고 간편하고 새로운 분석 방법의 개발에 토대가 될 수 있는 결과라고 할 수 있겠다.
