Phytochromes are red/far-red light receptors that regulate various light responses by initiating transcriptional cascades responsible for changing the expression patterns of 10 - 30% of the entire plant transcriptome. Several transcription factors that are thought to participate in this process have been identified, but the underlying molecular functions have not yet been fully elucidated. Here, I investigate the role of such transcription factor, PIF3, on the anthocyanin and chlorophyll biosynthesis. PIF3 is a nuclear localized bHLH protein whose activity is regulated by active phytochromes. PIF3 is known to regulate hypocotyl elongation, anthocyanin biosynthesis, shoot gravitropism, and photosynthetic activity. I found that PIF3 positively regulate anthocyanin biosynthesis by activating transcription of anthocyanin biosynthetic genes, but the positive effects of PIF3 required functional HY5. Chromatin immunoprecipitation analyses indicated that both PIF3 and HY5 regulate anthocyanin biosynthetic gene expression by directly binding to different regions of the gene promoters in vivo. Additional experiments revealed that PIF3 bound to the promoters regardless of light and HY5.
I additionally investigate the role of PIF3 in chlorophyll biosynthesis. I found that PIF3 negatively regulates the expression of photosynthetic genes and chlorophyll biosynthetic genes including CAB and GUN5. Consistent with the higher expression of chlorophyll biosynthetic genes in the pif3 mutant, etiolated pif3 seedlings showed severe photooxidative damage upon the transfer to light. The photooxidative damage is partly due to the overexpression of chlorophyll biosynthetic genes including GUN5 as gun5pif3 double mutant does not show any photooxidative damage. Interestingly, PIF3 is necessary for plastid-to-nucleus signaling, when the tetrapyrrole intermediates are overproduced. Moreover, tetrapyrrole intermediates stabilize the PIF3 protein to form a negative feedback loop in the chlorophyll biosynthetic pathway. I’m currently assuming either heme or protochlorophllide can be a specific molecule stabilizing PIF3 protein in the chlorophyll biosynthesis feedback loop.
PIF3, PIF4, PIL5, and PIL6 share common feature on the regulation of various light responses. Not only PIF3, but also PIF4, PIL5, and PIL6 negatively regulate chlorophyll biosynthesis, and their protein was stabilized by overproduced tetrapyrroles. In the regulation of hypocotyl elongation, all four proteins negatively act in both red and far-red light mediated inhibition of hypocotyl elongation. In addition, pif3pif4pil5pil6 quadruple mutant represent constitutive photomorphogenesis in darkness, therefore, I revealed that four bHLH proteins act redundantly, and necessary to skotomorphogenesis.
식물은 토양에 뿌리를 내리고 사는 고착생물로 환경의 변화가 일어나도 움직일 수 없다는 한계를 가지고 있다. 따라서 환경의 변화에 얼마나 적합하게 대응하는가가 식물의 생존에 직접적으로 연결되어있다. 빛은 식물에 작용하는 가장 중요한 환경요인으로 씨앗의 발아에서부터 식물 생장, 개화, 노화에 이르기까지 모든 발달과정을 조절한다. 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에는 Red/Far-red 빛을 인지하는 광 수용체로 파이토크롬이 있는데 파이토크롬이 빛을 흡수하면 다양한 신호전달 메커니즘을 통해 식물 전체 transcriptom의 10~30%의 유전자 발현 양상을 변화시킨다. 본 연구에서는 파이토크롬과 직접 결합해서 신호전달을 담당하는 phytochrome interacting factor 3 (PIF3)의 전사조절 단백질로서의 기능과 식물이 빛에 반응해 생성하는 중요한 두 색소인 안토시아닌과 엽록소 합성에 PIF3가 미치는 영향을 분자 생물학적으로 분석했다.
안토시아닌은 식물에 존재하는 보라색 색소로 UV에 의한 세포 손상을 막고 곤충을 유인해 수분이 잘 일어나도록 하는데 PIF3는 안토시아닌 합성을 촉진시켰다. CHS, CHI, F3H 등 이미 밝혀진 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 조사해본 결과, PIF3에 의해 유전자 발현이 증가했다. 또한 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay를 통해 PIF3가 유전자 프로모터의 특정 G-box 부분에 특이적으로 결합해 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 안토시아닌은 far-red 빛 조건에서 가장 많이 축적되고, dark 상태나 red 빛 조건에서는 거의 만들어지지 않는다. 분자적으로도 dark 또는 red 빛 하에서는 PIF3 단백질이 많다고 하더라도 안토시아닌 생합성 유전자의 발현이 증가하지 않았다. 그러나 PIF3는 빛의 존재 유무, 빛의 파장에 관계없이 항상 같은 프로모터의 G-box 부분에 결합하는 것을 확인했다. 마찬가지로 phyB 돌연변이체 식물에서도 PIF3는 여전히 프로모터에 잘 결합을 했고, 이를 통해 파이토크롬이 PIF3가 DNA에 결합하는 능력을 조절하는 것은 아니라는 것을 확인했다.
엽록소는 식물이 빛 에너지를 흡수해 광합성을 하는데 가장 중요한 색소로, 그 양이 적으면 광합성이 원활하게 일어나지 않아 생장이 저해되고, 지나치게 많이 합성될 경우 오히려 빛 에너지를 과도하게 흡수해 oxidative stress를 일으키게 된다. 따라서 식물체 내의 엽록소 합성량은 주변 환경의 변화, 식물체 내의 물질대사 변화 등과 밀접하게 연계되어 조절받는다. PIF3는 엽록소 합성 유전자 발현을 억제했지만 안토시아닌 생합성과는 달리, 엽록소 합성 유전자들의 프로모터에 직접 결합하지는 않았다. 이를통해 PIF3에의해 조절받는 하위단계 전사조절 단백질들이 엽록소 합성을 조절하는 transcriptional network을 형성할 것이라고 추측할 수 있었다.
엽록소 합성 초기 물질인 δ-aminolevulinic acid (ALA)를 처리한 식물은 엽록소 전구체 양이 증가하는데, 그 결과 음성 피드백이 작동해 엽록소 생합성 유전자들과 광합성 유전자들의 발현은 반대로 감소했다. 그러나 pif3 돌연변이체에서는 음성피드백이 원활하게 일어나지 않았다. 이를 통해 PIF3가 엽록소 합성의 음성피드백 과정에 꼭 필요하다는 것을 알 수 있었다. 또한 단백질 분석을 통해 엽록소 전구체들이 늘어나면 PIF3 단백질이 매우 안정화된다는 것을 알 수 있었다. 정리하면, 엽록소 합성이 증가하면 그 전구체들이 PIF3 단백질을 과량 축적시키고 PIF3는 엽록소 생합성 유전자의 발현을 억제해 다시 엽록소 합성이 줄어들게 만드는 음성 피드백을 형성한다.
PIF3와 homology를 보이는 PIF4, PIL5, PIL6는 엽록소 생합성 및 식물 하배축 길이 조절에서 PIF3와 같은 기능을 나타냈다. 이들은 서로 reduandant 하게 작용하며, 네 유전자에 모두 돌연변이가 생기면 암 상태에서도 마치 빛 조건에서 자라는 것과 같은 효과를 보였다. 이를 통해 PIF3, PIF4, PIL5, PIL6는 암 상태에서 식물의 skotomorphogenesis 과정이 원활하게 일어나는데 중요하게 작용한다는 것을 알 수 있었다.
