Confocal microscopy has been a versatile tool for investigating various specimens in bioscience, material science, semi-conductor industry and etc. Recently, its applications are expanded to the bio-medical field along with the confocal endo-microscopy. Confocal fluorescence microscopy is an essential tool for modern biological research such as cellular and molecular biology. The increasing number of available fluorophore markers and labeling techniques allow the creation of increasingly complex multicolored samples; and then the confocal fluorescence microscopy is faced to measure the various fluorophores simultaneously.
Multi-spectral fluorescence imaging techniques make use of the diversity of available markers to visualize different aspects of a specimen with specific fluorescent labels. Various spectral imaging microscopes have been proposed that combine spectrally decoding components such as prism or grating. Emission lights are spatially decoded as wavelengths and these lights are then simultaneously detected as selected wavelength bandwidths. In this way, the localization of several cellular proteins can be compared during processes such as cell division or secretion. The amount of information grows as the number of fluorophores increasing, leading to the need for complex quantitative analyses of the acquired data.
However, fluorescence signals may not be completely separated into the different channels due to the effect of spectral bleed-through (SBT). SBT can occur when a specimen is multi-labeled and/or when there is significant auto-fluorescence. It is caused by the overlapping of fluorescence emission. As a result, the fluorophores cannot be distinguished, and a merged image can appear as co-localization if SBT exists. The SBT phenomenon can be reduced by narrowing the detection bandwidth, but this will also decrease the signal efficiency what is considered as a considerable trade-off in fluorescence applications. SBT can be eliminated using a spectral unmixing algorithm. Using a spectral unmixing method, the SBT effects are mathematically removed using the relative contribution of fluorophores to each detection channel. However, the unmixing process can only be as good as the reference spectra. If the reference spectra data are affected by noise, the unmixing error also will be increased. The unmixing algorithm, moreover, requires more processing time as the number of detectors increases.
In this thesis, multi-confocal spectral imaging microscopy (McSIM) is proposed to reduce SBT. SBT is reduced when the illumination spots are separated temporally or spatially. Thus, with McSIM, the excitation lights are simultaneously illuminated as in conventional spectral microscopy, but the illumination spots of each excitation light are spatially separated on the specimen plane. The design variables and their relationship for the implementation of multi-confocal microscopy are studied, and the design result after an optimization procedure is presented in this thesis. In the proposed microscopy, an acousto-optic tunable filter (AOTF) is utilized to separate the excitation wavelengths from the fluorescence wavelengths in place of a multi-band dichroic mirror. A dichroic mirror is not suitable for fluorescence applications because its spectrum is fixed and thus cannot follow the spectrum changes of various dyes. However, in an AOTF, wavelength selection is electrically adjustable as it uses the acousto-optic interaction of a birefringent material. In addition, the AOTF has high-wavelength selection resolution (of approximately 2nm) and can separate several wavelengths simultaneously. The performance of the AOTF as a fluorescence beam splitter was experimentally verified.
A new scheme of multi-spectral detector (MSD) is proposed to detect the fluorescence emission lights from multi-confocal microscopy. A prism or grating has been used routinely to decode fluorescence lights as wavelength for spectral detection. In the proposed MSD, the dispersion characteristic of the zero-order beams in an AOTF is utilized instead of a prism. The fluorescence emission lights after passing the AOTF are spatially decoded as the wavelength by the dispersion of an AOTF. The detection wavelength is adjustable using a slit that is positioned in an appropriate position. The birefringent characteristic of the AOTF material, however, disturbs the spectral detection. As the refractive indices of an AOTF vary according to the polarization state, the propagating direction of the emission light is different depending on the polarization state. Thus, in this thesis, the new method is proposed to compensate for only the birefringence of an AOTF while holding the dispersion constant. The birefringence is compensated for using a birefringent beam displacer and a geometrical relation of imaging lens in the proposed MSD. The theoretical modeling and experimental results are presented. The wavelength error is reduced from 40nm to 4nm after the birefringence compensation.
The proposed McSIM was implemented and its optical performance was evaluated experimentally using various specimens. The lateral and axial resolutions were evaluated with a 100nm gold-bead and high-reflection mirror, respectively. The lateral resolution was found to be 320nm, 350nm and 480nm for the multiple excitation wavelengths of 488nm, 543nm and 633nm, respectively. The axial resolution was measured as 1.08μm, 1.27μm and 1.32μm for the aforementioned excitation wavelengths respectively. The illumination spots were laterally separated at a distance of 3.0μm in the fast scanning direction and were axially aligned within 150nm on the specimen plane.
The SBT effect was measured using fluorescence specimens. It was found that these effects are reduced considerably in the proposed McSIM. In the measurement of the standard fluorescence beads, the Pearson’s coefficient (PC) was reduced to -0.01 in the McSIM compared to the value of 0.25 with conventional confocal microscopy. In the measurement of the biological cell (mitochondria and F-actin), the PC was reduced to 0.44 in the McSIM while it was 0.84 with conventional confocal microscopy. The reduced SBT was also verified using a scatter plot for each specimen.
The proposed multi-confocal spectral imaging microscopy reduces the SBT effects when multiple fluorescence information is acquiring simultaneously in a multi-labeled specimen. An AOTF is used to separate the excitation wavelengths from fluorescence wavelengths. The new method that compensates for the birefringence of an AOTF while holding the dispersion constant is proposed to utilize the dispersion of an AOTF for multi-spectral detection. The additional beam displacer is inexpensive and the system configuration is not complex. Thus the McSIM is expected widely used in fluorescence applications.
공초점 현미경은 생물학, 재료과학, 반도체 산업 등 다양한 시편을 검사하는 장비로 널리 사용되고 있다. 최근에는 공초점 내시경을 통해서 생의학 분야로 그 응용 분야가 확대되고 있다. 형광 공초점 현미경은 세포질과 분자 생물학과 같은 현대 생물학 연구를 위해 매우 필수도구이다. 또한, 형광 표식물질과 표지 기법의 증가로 다색 시편의 정보는 계속 복잡해진다. 따라서, 형광 공초점 현미경은 여러 개의 형광 표식을 동시에 측정해야 하는 실정이다.
이와같은, 다양한 형광 표식 물질로부터 생성되는 정보를 측정하기 위해 다분광 형광 영상 기술이 사용되고 있다. 따라서 프리즘이나 그레이팅과 같이 분광특성을 갖는 부품을 이용한 여러가지 분광 현미경이 개발되고 있다. 형광은 분광 현미경에서 파장에 따라서 공간적으로 디코딩되고, 다시 몇 개의 파장영역으로 분리되어 검출된다. 이러한 방식으로 세포 분열이나 분비와 같은 과정에서 여러가지 세포 단백질의 분포를 비교 관찰할 수 있다.
여러 개의 형광물질을 사용할수록 획득하는 정보량이 증가하지만, 그에 따라 정보의 분석이 더욱 복잡해진다. 여러 종류의 형광을 동시에 검출하는 경우, 블리드 쓰루 현상으로 인해 각 형광신호를 완전하게 분리해서 검출하지 못하는 경우가 있다. 블리드 쓰루 현상은 여러 개의 형광물질이 동시에 표지되었거나 자가형광이 존재하는 경우 발생되는데, 여러 형광 스펙트럼의 중첩에서 기인한다. 결과적으로 각 형광물질로부터 나오는 정보를 구분할수 없으므로 왜곡된 정보를 제공하거나 분석의 어려움을 초래한다. 블리드 쓰루는 검출파장영역을 좁게함으로써 크게 줄일 수 있지만, 검출되는 형광 강도 또한 줄어드는 단점이 있다. 블리드 쓰루 현상은 분광 분해 방법으로 제거될 수 있다. 하지만 분광 분해 방법의 정확도는 기준 형광 스펙트럼의 정확도에 따라 크게 좌우되기 때문에 기준 스펙트럼의 노이즈에 따라 영향을 받는다.
본 논문에서는 블리스 쓰루를 줄이기 위해 다중 공초점 분광 현미경에 제안되었다. 여기 스팟이 시간적 또는 공간적으로 분리될 때 블리드 쓰루는 줄어드는데, 본 논문에서는 공간적으로 분리된 여기 스팟을 이용해 블리드 쓰루를 줄이는 방법을 사용하였다. 따라서 다중 공초점 분광 현미경을 구현하기 위한 설계 변수가 연구되었고 최적한 과정을 통한 설계 결과가 제시되었다. 제안된 시스템에서는 여기파장과 형광파장을 분리하기 위해 이색거울 대신에 음향광학가변필터가 사용되었다. 이색거울의 스펙트럼은 고정되어 있기 때문에 형광물질의 변화에 유연하게 대응하지 못하는 반면, 음향광학가변필터는 전기적으로 투과 스펙트럼을 조절할 수 있기 때문에 다색 형광 응용분야에서 형광-여기파장 분리기로 사용되기에 매우 적합하다. 또한 파장 분해능이 약 2nm수준으로 우수하고 여러 파장을 동시에 분리할 수 있다. 형광-여기파장 분리기로서의 성능이 실험적으로 측정되었다.
제안된 다중 공초점 분광 현미경으로부터 발생될 형광을 검출하기 위해 새로운 다분광 검출기가 제안되었다. 형광-여기파장 분리기로 사용된 음향광학필터는 0차빔 방향으로 투과하는 빛을 분산시키는 특성을 추가로 갖고 있다. 따라서 제안된 다분광 검출기에서는 형광을 파장에 따라 디코딩하기 위해 프리즘 대신 음향광학가변필터의 분산 특성을 이용하었다. 즉, 본 논문에서 음향광학가변필터는 형광-여기파장 분리기 뿐만 아니라 형광에 대해서는 프리즘의 역할까지 수행하게 된다. 하지만, 음향광학가변필터의 복굴절 특성으로 인해 형광은 편광방향에 따라 각각 다른 방향으로 진행하고, 이것은 다분광 검출을 방해하는 요인이 된다. 따라서 음향광학가변필터의 분산특성을 그대로 유지하면서 복굴절 특성을 보정하는 방법이 새롭게 제안되었다. 본 논문에서는 분산특성을 유지하면서 복굴절 특성을 보정하기 위해 빔 디스플레이서와 렌즈의 기하광학적인 원리를 도입하였다. 이론적인 모델이 제시되었고 그 성능을 실험적으로 검증하였다. 복굴절 특성으로 인한 파장 오차는 40nm였으나 보정 후 4nm로 성능이 향상되었다.
본 논문에서 제안된 다중 공초점 분광 현미경이 제작되었고, 다양한 시편을 통해 그 성능을 검증하였다. 횡방향 및 종방향 광학 분해능은 각각 100nm 크기의 금입자와 평면 거울을 사용하여 평가되었다. 횡방향 분해능은 488nm, 543nm, 633nm의 여기 파장에 대해서 각각 320nm, 350nm, 480nm로 측정되었다. 또한, 종방향 분해능은 각 여기 파장에서 각각 1.08μm, 1.27μm, 1.32μm로 측정되었다. 각 여기 스팟은 횡방향으로 3.0μm 간격으로 일정하게 정렬되었고, 종방향으로 150nm이하의 오차로 같은 평면상으로 정렬되었다.
블리드 쓰루 현상에 대한 성능평가를 위해 형광 시편을 측정하였다. 블리드 쓰루를 정량적으로 나타내기 위한 지수로 피어슨 상관 계수를 도입하였다. 표준 형광 입자의 경우, 기존 공초점 현미경의 경우 피어슨 계수는 0.25로 계산되었으나, 다중 공초점 분광 현미경으로 측정한 결과 -0.01로 줄어들었다. 일반적인 생물 시편에 대해서도 블리드 쓰루의 영향을 측정하였다. 기존 공초점 현미경의 경우 피어슨 계수는 0.84로 측정되었으나, 다중 공초점 분광 현미경으로 측정한 결과 0.44로 감소하였다. 따라서 본 논문에서 제안된 다중 공초점 분광 현미경으로 블리드 쓰루 현상이 감소하는 것을 알 수 있다. 블리드 쓰루 영향이 감소하는 것은 각 시편에서 측정한 이미지에 대한 산점도를 통해서도 확인할 수 있다.
본 논문에서 제안된 다중 공초점 분광 현미경을 사용하여 다색 표기된 형광 시편에서 블리드 쓰루의 영향을 줄일 수 있다는 것을 입증해보였다. 본 논문에서는 음향광학가변필터를 형광-여기파장 분리기 뿐만 아니라 다분광 검출기를 위한 분산 장치로도 사용하기 위해, 복굴절 특성을 보정하는 새로운 방법이 제안되었다. 복굴절 특성의 보정을 위해 사용된 빔 디스플레이서는 고가의 부품이 아니고, 제안된 시스템 구성은 비교적 간단하다. 따라서 다중 공초점 분광 현미경은 다색표기된 형광 응용분야에서 널리 사용될 것으로 기대된다.
