Non-protein-coding RNAs (ncRNAs) employ a wide range of cellular functions from protein synthesis to regulation of gene expression. Mostly, ncRNAs, as inhibitors, repress the expression of target messenger RNA (mRNA) through formation of RNA-RNA duplex, such as antisense RNA. In contrast, a few ncRNAs stabilize target mRNAs and increase their protein expression, either directly or via effects on translation. In the recent study, the addition of increasing amounts of cognate antisense RNA decreases the cellular concentration of the target RNA in Escherichia coli. For more detailed control of ncRNA or antisense RNA with stable system, I constructed RNA expression plasmid vector by using the P1 stem of M1 RNA. The P1 stem is essential for M1 RNA stability, a catalytic unit of RNase P ribozyme. The prototypical vector was successfully constructed and antisense sequences were subcloned into the plasmid. The antisense RNAs were designed to be targeted to rnpB-CAT-lacZ fusion mRNA, and generally decreased β-galactosidase activity up to 32% in E. coli. Since it is possible that the structural difference or mismatching level leads to the different regulatory consequence for target RNAs, I set to generate the new regulatory RNA molecules from antisense RNA molecules. For this purpose, we constructed randomly 10% mutated antisense RNA libraries. I screened several clones from the libraries and found that they show large variance of β-galactosidase activity. These data imply that new types of regulatory RNA molecules can be generated from antisense RNA molecules by minor sequence changes.
단백질을 암호화하지 않는 리보핵산 (ncRNAs)은 단백질 합성에서부터 유전자 발현의 조절에 이르기까지 다양한 세포 내 기능을 담당한다. 대부분 ncRNA는 역배열의 리보핵산 (antisense RNA)과 같은 억제자로, RNA-RNA 복합체를 형성하여 표적 전령 RNA (mRNA)의 발현을 억제한다. 이와는 반대로, 몇몇 ncRNA는 직접적으로 또는 번역과정을 통해 표적 mRNA를 안정화하고 이들의 단백질 발현을 증가시킨다. 최근, 대장균에서 동종의 antisense RNA의 양이 증가함에 따라 표적 RNA의 세포 내 양이 감소하였다는 결과가 보고되었다. 안정한 발현 체계 속에서 ncRNA와 antisense RNA의 조절을 위해, M1 RNA의 P1 줄기를 이용하여 RNA를 발현시킬 수 있는 플라스미드 벡터를 제조하였다. M1 RNA는 리보자임인 RNase P의 촉매로 P1 stem은 M1 RNA의 안정성에 필수적인 부분이다. RNA 발현을 시키기 위한 원형 플라스미드 벡터는 성공적으로 제조되었고, lacZ 유전자의 역배열 서열을 삽입하였다. lacZ 역배열 리보핵산 (antisense RNA)은 rnpB-CAT-lacZ mRNA를 표적으로 한다. 그 효과를 β-galactosidase assay 를 통해 실험한 결과, lacZ antisense RNA는 β-galactosidase activity를 최고 32% 감소시켰다. ncRNA의 구조적 차이 또는 염기쌍의 매치 정도가 표적 RNA의 조절에 다른 결과를 생산해낼 수도 있기 때문에, antisense RNA로부터 새로운 RNA 조절 분자를 만들고자 하였다. 그래서 무작위로 10% 돌연변이가 일어난 ncRNA 집단을 제조하였다. ncRNA 집단으로부터 여러 개의 클론을 선택했고 β-galactosidase assay를 통해 다양한 값의 β-galactosidase activity를 갖는 것을 확인하였다. 이렇게 작은 염기서열의 변화를 통해 antisense 분자로부터 ncRNA 분자를 얻었고, 그 구조에 따라 다양한 기능을 가짐을 보았다.
