We describe herein, a reliable multiplex assay strategy to detect human genetic mutations in breast cancer susceptibility gene BRCA1 on a zip-code microarray using single base extension (SBE) reaction. Multiplex PCR amplification was performed to amplify the genomic regions containing the mutation sites. The PCR products were then employed as templates in subsequent four separate multiplex SBE reactions, one with each of four different biotin-labeled dideoxy NTPs (ddNTPs) and the other three unlabeled ddNTPs. All SBE primers, terminating one base before mutation sites, were extended by a single base at each corresponding mutation site, but biotin was labeled only through the reaction with the biotin labeled ddNTP. Hybridization of the SBE products to zip-code microarray was followed by staining with streptavidin-Cy3, leading to successful genotyping of several selected BRCA1 mutation sites with a wild-type and heterozygote mutant samples from breast cancer patients. This work represents one of the few successful verification of the DNA microarray-based reliable diagnosis of human genetic mutations
BRCA는 유방암 및 난소암의 유전적 원인이 되는 genetic susceptibility gene이고, 대략 유방암의 7%, 난소암의 10%가 이 유전자들의 돌연변이와 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 서양 지역보다는 발병률이 낮지만, 유방암은 한국여성에 있어서 가장 많이 발생하는 암이다. 생활 패턴이 점점 서구화 되면서 이러한 질병들의 발병이나 이와 관련된 사망률이 점점 증가하는 추세이고, BRCA gene의 변이는 이러한 대부분의 유전적인 유방암을 가지고 있는 가계의 주요한 원인이 된다.
유전적인 유방암은 무엇보다도 조기에 발견을 하는 것이 중요하다. 따라서 본 연구에서는 한국인 특이 BRCA gene의 변이를 빠르고 정확하게 진단하기 위하여 single base extension(SBE) 와 zip-code microarray를 도입하였다. 먼저, multiplex PCR을 이용하여 mutation site를 포함하는 PCR amplification product를 만들었다. 이렇게 만들어진 PCR product를 template로 사용하여, 4개의 서로 다른 multiplex SBE 반응을 수행하였다. 이러한 SBE reaction product를 zip-code microarray에 hybridization 시킨 후, streptavidin-Cy3을 반응시켜 결과를 확인하였다. 한국인 특이적인 BRCA gene mutation을 갖는 sample과 mutation이 없는 sample을 SBE와 zip-code microarray를 이용하여 테스트 하여서 성공적으로 mutation의 여부를 진단할 수 있었다.
본 연구에서는 한국인 특이적인 BRCA mutation site를 진단할 수 있는 DNA microarray를 이용한 multiplex assay 기술을 개발하였다. 이러한 결과는 DNA microarray를 한국인 특이적인 BRCA 유전자 변이 진단에 실질적으로 사용 가능하다는 것을 증명하며, 여러 가지 다른 질병과 관련된 유전적 변이의 진단에도 응용 가능하다는 것을 보여준다.
