Ascites formation arises from imbalance between production and drainage of peritoneal fluid, but little is known how peritoneal lymphatic vessels relate to form ascites during the intraperitoneal production of monoclonal antibody by implantation of the myeloma cells in mouse. Here we identify and characterize peritoneal lymphatic vessels in the intraperitoneal myeloma-bearing mice, particularly at the diaphragm, which is the main organ for draining peritoneal fluid. Myeloma cell line FO and pristane (FO+P) were implanted into peritoneal cavity of 8~10 weeks of male BALB/c mice. Profound lymphangiogenesis and lymphatic remodeling occurred in the pleural side of diaphragm, whereas massive and disseminated carcinomatosis was observed in the peritoneal side of diaphragm in the mice implanted with FO+P. The observed lymphangiogenesis was mainly resulted from proliferation of lymphatic endothelial cells (LECs), but not by extension and hypertrophy of LECs. Diaphragmatic lymphatic vessel drainage assay using India ink revealed that lymphatic vessels both on the muscles and central tendon regions were surprisingly non-conductive to peritoneal fluid. Histological assay revealed that massively attached myeloma carcinomatosis and pristane-induced inflammation and fibrosis were main factors to inhibit drainage of peritoneal fluid. Both ELISA assays and the depletion experiment using Clodronate liposome indicated that CD11b+ macrophages play an important role in the formation of the inflammatory-tumor mass and the ascites via inflammatory cytokines. Moreover, the implantation of FO+P markedly induced expression and secretion of VEGF-A from host and implanted myeloma cells. The increased VEGF-A was other prime molecule responsible for the ascites formation through peritoneal vascular leakage. Accordingly, blockade of VEGF-A by treatment of VEGF-Trap significantly suppressed the ascites formation induced by FO+P implantation. Altogether, non-conductive lymphangiogenesis and ineffective lymphatic flow in diaphragm, and VEGF-A-induced peritoneal vascular leakage are main determinants for ascites formation during the intraperitoneal myeloma implantation-based antibody production.
복수 형성은 그 방법이 가지는 많은 장점 때문에 단일 항체를 생성하는데 보편적으로 이용되어 왔다. 복수는 여러 cancer model에서 발견되는 병변으로 지금까지는 혈관의 누출을 주요한 원인으로 보고 있다. 하지만 단일항체 생성시 복수 형성의 과정이나, 복수 형성과 임파관의 상관성 등은 잘 알려져 있지 않다.
이 실험에서 우리는 단일 항체 생성 방법을 따라, 8~10 주령 BalB/c 실험용 쥐에 pristane과 myeloma 세포 주를 이식하고, 복강 내 장기 중 특히 체액의 배수에 주요한 역할을 하는 횡격막에서의 임파관 변화를 관찰하였다. 횡격막의 흉강 쪽 부분에서는 임파관이 급격하게 증가한 것이 관찰된 반면, 복강 쪽 부분에서는 거대한 암종증이 부착 되어 임파관을 관찰하는 것이 불가능 했다. 이렇게 증가한 임파관은 임파관 내피 세포 (Lymphatic endothelial cells, LECs)의 단순한 확장에 의해 생긴 다기 보다는 증식에 의해 발생된 것이었다. 놀랍게도, 급격하고 거대한 임파관 형성에도 불구하고 횡격막의 임파관은 복강 내 체액을 제대로 흡수 및 배수하지 못하는 것으로 나타났다. 조직학적 분석 결과, pristane에 의해 유도된 염증 반응과 fibrosis 형성, 그리고 뒤이은 myeloma 세포 이식 후 거대하게 부착된 암종증이 정상적인 임파관 작용을 막는 주요한 원인 이었다. 효소결합 면역흡수 분석법 및 Clodronate liposome을 이용해 대식세포를 선택적으로 depletion시킨 실험은, CD11b+ 대식세포와 염증성 cytokine이 염증성 종양과 복수 형성에 중요한 역할을 함을 보였다. 효소결합 면역흡수 분석 실험결과, VEGF-A의 증가도 크게 나타났는데 이 VEGF-A는 혈관 누출을 유도하여 복수 형성에 또 하나의 중요한 요소가 되는 것으로 보인다. 비슷한 결과로, VEGF-Trap으로 VEGF-A를 억제하였을 때 복수 형성이 매우 감소하였다. 정리하면, 염증반응과 종양의 dissemination으로 정상적인 흡수 및 배수 기능을 상실한 임파관은 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 누출과 더불어 복수를 형성하는데 중요한 요인이다.
