The stirred tank bioreactor is the most important type for industrial recombinant protein production processes. The impact of environmental parameters on process performance is one of the most crucial issues when cultivating mammalian cells in a bioreactor. In a systematic approach agitation speed, dissolved oxygen, pH and temperature of rCHO cell cultures in controlled bioreactors were varied and investigated the impact on cell growth, antibody production and cell metabolism. It was found that the low pH and temperature exerted the most significant effects on cell line performance by mainly reducing cell growth and metabolism leading to an increased viable cell integral.
Perfusion culture of recombinant Chinese hamster ovary cells, producing recombinant antibody against the S surface antigen of Hepatitis B virus, were carried out in continuous and intermittent mode using a Centritech Lab II Centrifuge. In the continuous perfusion process, despite the absence of shear stress from the pump head, long-term operation was not possible because of continuously repeated exposure to nutrient limitation, oxygen limitation, and low temperature, as well as shear stress from centrifugal force. In the intermittent perfusion processes, the frequency of cell-passage through the centrifuge was substantially reduced, compared with the continuous perfusion mode; however, the degree of reduction could not guarantee stable long-term operation. Although various operating parameters were applied in the intermittent perfusion cultures, high cell densities could not be maintained stably. In a single bioreactor culture system, a specific cell that is returned from the centrifuge to the bioreactor could be transferred from the bioreactor to the centrifuge again in the next cycle. This repetitive damage, caused by shear stress from the pump head and centrifugal force, as well as exposure to suboptimal conditions such as nutrient limitation, oxygen limitation, and low temperature below 37℃, were more serious at higher perfusion rates. Subsequently, damaged cells and dead cells were continuously accumulated in the bioreactor. Culture temperature shift from 37℃ to 33℃ increased antibody concentrations but showed inhibitory effects on cell growth. The negative effects of lowering culture temperature on cell growth overwhelmed the positive effects on antibody production. To protect cells from shear stress, Pluronic F-68 was two-fold concentrated in the culture medium; nevertheless significantly higher concentration of Pluronic F-68 (2 g/L) may have inhibitory effects on cell growth.
Based upon the results of batch and scale-down intermittent perfusion processes, a cell-once-through (COT) perfusion concept was applied to a dual bioreactor system coupled to a Centritech Lab II Centrifuge for culture of recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells for monoclonal antibody production. In this new culture mode, i.e., the COT perfusion process, total spent medium was transferred the centrifuge and a fixed percentage was removed. Approximately 99% of viable cells are transferred to another bioreactor filled with fresh medium by single operation of the Centritech Lab II Centrifuge system for about 30 minutes. Accordingly, a significant reduction of the cell-passage frequency to the centrifuge led to minimization of cell damage caused by mechanical shear stress, oxygen limitation, nutrient limitation, and low temperature outside the bioreactor. The effects of culture temperature shift and fortified medium on cell growth and recombinant antibody production in the COT perfusion process were investigated. Although the suppressive effects of low culture temperature on cell growth led to a loss of stability in a long-term COT perfusion culture system, the average antibody concentration at 33℃ was 157.8 mg/L, approximately 2.4-fold higher than that at 37℃. By the use of a fortified medium at 37℃, rCHO cells were maintained at high density above $1.2\times10^7$ cells/mL, and antibody was produced continuously in a range of 260 to 280 mg/L in a stable long-term COT perfusion culture. The proposed new culture mode, the COT perfusion approach, guarantees the recovery of rCHO cells damaged by lowered temperature or high lactate and ammonium concentration. It will be an attractive choice for minimization of cell damages and stable long-term antibody production with high cell density.
재조합 CHO 세포 ($CS^{\ast}$ 13-1.00) 의 생물반응기에서의 회분식 배양을 통해 세포의 성장 및 대사와 항체 생산에 미치는 환경적 변수의 영향을 확인하였다. 두 종류의 교반기를 이용한 배양으로부터 배양기가 시스템 내에서의 산소전달에 미치는 영향 및 세포에 미치는 shear stress 에 대하여 분석하였으며, 다양한 교반 속도와 용존 산소 농도를 이용하여 배양을 진행하였다. 그 결과, 일정 범위 (60 rpm) 이하의 교반 속도와 10% 이상의 용존 산소 농도는 세포 성장 및 항체 생산에 큰 영향을 주지 않았다. 배양 온도와 pH가 세포 성장과 재조합 항체 생산에 미치는 영향에 관한 연구 결과를 수행하였다. 배양 온도를 37 ℃에서 33 ℃로 변화시켰을 때 누적 생존 세포수와 최종 항체 생산량이 37 ℃에서 지속적으로 배양했을 때보다 크게 증가하였다. 배양 pH가 6.6에서 7.4로 증가함에 따라 포도당 소모 속도 및 젖산 생산 속도는 증가하였고, 낮은 pH (6.6)에서는 배양시간의 연장 및 누적 생존 세포수의 증가, 최종 항체 생산량의 증가를 확인하였다.
Centritech Lab II 원심분리 시스템에서의 생물 반응기를 이용한 CHO 세포의 관류배양에 관한 연구에서는 연속적 관류 배양과 간헐적 관류배양을 비교하였다. 연속적 관류배양에서는 원심분리 시스템의 펌프와 회전원통으로부터 세포가 연속적으로 손상을 받는 것을 알 수 있었다. 간헐적 관류배양에서는, 관류 속도의 증가에 따른 원심분리기의 작동시간과 대기 시간의 효과, 온도를 37 ℃에서 33 ℃로 낮추었을 때의 효과, 세포의 표면을 보호해주는 Pluronic F-68의 농도를 2배로 늘렸을 때의 효과를 확인하였다. 하나의 생물반응기를 이용한 관류배양 시스템에서는 다양한 작동 변수에도 불구하고 세포의 손상은 불가피하였으며, 이를 통계적 분석을 통하여 증명하였다.
이러한 세포의 손상을 최소화하기 위하여 cell-once-through (COT) 관류배양법을 Centritech Lab II 원심분리 시스템에 도입하였다. COT 방식에서 소모된 배지는 단 한번의 원심분리기 작동으로 모두 교체가 가능하며 세포는 원심분리기를 최소한의 횟수로 통과함으로써 손상을 최소화할 수 있었다. 배양온도를 33 ℃로 낮추거나 농축된 배지를 시스템에 공급함으로써 세포수의 감소가 있었으나, 재조합 항체의 농도가 3배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 온도의 하강 전략보다 농축된 배지를 이용하는 전략이 안정적인 시스템 운영면에서는 더욱 효과적인 것으로 나타났다. 또한, COT 방식의 특성을 이용하여 낮은 배양온도로 인한 세포의 손상이나 농축된 배지 사용으로부터 야기되는 젖산과 암모늄이온의 높은 농도로 인한 세포의 손상으로부터 세포가 회복될 수 있음을 확인하였다. 또한, 다단계 COT 관류배양법의 수학적 모사를 통해 배지의 절약 및 높은 항체 농도의 효과를 얻을 수 있었다.
