Analysis of protein modifcations is essential for understanding the fidelity of most biological functions in living systems as well as for developing therapeutics and diagnosis. Highly sensitive detection of protein-modifying enzymes or post-translational modifications (PTMs) of proteins was described here by using the nanoparticle-based biochip systems. In the first approach, the powerful use of nanoparticles (AuNPs) in secondary ion mass spectrometry (SIMS) was demonstrated. As a result of the secondary ion mass singal enhancement of peptides by AuNPs, the sensitive detection of phosphorylation and proteolytic acitivity was attained, and the control of the orientation and length of peptides on non-biofuling surfaces improved the detection efficiency. Unlike traditional matrix-assisted laser desorption/ionization MS (MALDI MS), this nanoparticle-enhanced SIMS (NE-SIMS) enalbed matrix-free analysis and label-free chemical imaging with high sensitivity and selectivity. In the second approach, energy transfer between quantum dots (QDs) and AuNPs was employed for analyses of proteolytic acitvity and protein glycosylation. While the photoluminescence of donor QDs immobilized on glass was quenched by the AuNPs, the protolytic activity or protein glycosylation modulated the energy transfer between QD and AuNP with high specificity. Since the AuNPs can be used as common energy acceptors even in a distance of more than 10 nm, the conjugation of AuNPs and QDs with different colors enabled multiplexed assays of proteases and glycoproteins with higher sensitivity, which the conventional fluorescence resonance energy transfer (FRET) system does not provide. In addition, the chip-based energy tranfer system enabled reliable analysis with no aggregation of nanoparticles as well as with very small reaction volume, which led to a reliable detection in a high-throuput manner. In these regards, nanoparticle-based biochip system will be promising for diagnosis of PTM-associated diseases and screening of potential drug candidates with high sensitivity and selectivity in a high-throughput manner.
단백질은 궁극적으로 질병치료 및 진단과 관련된 주요 목표물질이다. 특히, 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 분해반응(proteolytic activity) 등의 단백질의 수식과정(post-translational modifications)은 생체내에서 다양한 생물학적 기능 및 활성을 부여하는 최종 단계이자 신약개발의 타겟이 되고 있다. 최근에 나노기술의 발전과 접목하여 이러한 단백실의 수식을 분석하는 일은 광범위하게 수행되어 왔지만 초고속 탐색 및 정량분석에는 많은 한계가 노출되어 왔다. 따라서, 본 연구에서는 나노입자의 장점을 이용한 바이오칩 기술을 개발하여 수식화된 단백질 혹은 단백실 수식에 참여하는 효소반응을 효과적으로 측정하는 방법을 소개하였다. 나노입자를 이용한 바이오칩 시스템은 크게 두가지 방법으로 연구하였다. 첫째는 질량분석에 기초한 단백질의 수식의 고감도 측정방법으로 금나노입자 (gold nanoparticle)와 이차이온 질량분석기 (secondary ion mass spectrometry)를 활용하였다. 다양한 칩 표면에 단백질 수식관련 효소의 기질로서 사용되는 펩타이드(peptide)를 금나노입자에 결합시킨 후 이온 빔을 조사하게 되면 금나노입자가 없을 경우보다 펩타이드의 질량신호가 수 십배 증폭되었다. 이 점에 착안하여 단백질 키나아제(kinase) 및 프로티아제(protease)의 활성 및 저해효과를 고감도로 정확히 측정하였다. 특히, 질량분석시 매트릭스(matrix)를 사용하지 않는 이점과 비특이적 흡착을 방지하는 표면을 개질화함으로써 보다 안정된 반응신호와 질량이미징 획득이 가능하여 효과적으로 단백질 수식관련 효소반응을 분석할 수 있었다. 둘째는 칩 표면위에서 나노입자간의 에너지 전이현상을 이용한 방법으로서 프로티아제의 활성 및 단백질의 당화정도를 분석하였다. 에너지 공여자로서 양자점(qauntum dot)을, 에너지 수여자로서 금나노입자를 사용하여 프로티아제의 활성 및 당단백질 농도, 단백질의 당화정도를 분석한 결과, 기존 형광공명에너지 전달(FRET) 시스템과 비교하여 볼 때 10 nm 이상의 거리에서도 측정이 가능하였고 측정감도가 향상되었다. 또한 동일한 금나노입자는 다양한 양자점과 함께 사용할 수 있고, 칩 표면위에서는 매우 적은 양만을 사용하기 때문에 동시분석 및 초고속 분석이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 측정기술은 단백질 수식에 관련된 다양한 단백질 및 효소의 활성을 고감도로 측정하거나 단백질 활성 저해제 (inhibitor)를 손쉽고 빠르게 스크리닝하는데 사용할 수 있어 세포내 신호전달 기작은 물론 신약개발에 광범위하게 접목될 수 있을 것으로 기대한다.
