The first decision made by an angiosperm seed, whether to germinate or not, is based on integration of various environmental signals such as light, moisture and temperature. The phytochromes act as red and far-red light photoreceptors to mediate various light responses including seed germination. However, the molecular mechanism by which phytochromes regulate seed germination has not been elucidated. Here, I showed that PIL5 protein, a basic helix-loop-helix transcription factor, is a key negative regulator of phytochrome-mediated seed germination by phenotypic analyses using PIL5 loss of function and gain of function mutant. PIL5 also regulated other phytochrome mediated light responses including inhibition of hypocotyls elongation and hypocotyls negative gravitropism. Like, PIF3, PIL5 also preferentially interacted with Pfr form of phytochrome. Expression analysis revealed that PIL5 repressed the expression of gibberellin (GA) biosynthetic genes (GA3ox1 and GA3ox2) and activated the expression of a GA catabolic gene (GA2ox). Consistent with these gene expression patterns, the amount of bioactive GA was higher in the pil5 mutant and lower in the PIL5 overexpression line. I also showed that red and far-red light signals trigger PIL5 protein degradation through the 26S proteasome, thus releasing the inhibition of bioactive GA biosynthesis by PIL5. In addition to GA metabolic genes, PIL5 also regulates the expression of GA repressor (DELLA) genes (GAI and RGA) and ABA metabolic genes and ABA metabolic genes (ABA1, NCED6 and CYP707A2). Chromatin immunoprecipitation analyses indicated that PIL5 directly binds to GAI and RGA promoters through G-box element, but not to GA and ABA metabolic gene promoters. Taken together, these results show that light signals perceived by phytochromes cause a reduction in the PIL5 protein level, which in turn regulates the transcription of two DELLA genes directly and that of GA and ABA metabolic genes indirectly. To find more PIL5 direct regulated genes in addition to GAI and RGA, I performed the ChIP-chip assay and microarray analysis. The ChIP-chip assay showed that PIL5 binds to its targets mainly through G-box element or its variants. Comparison the ChIP-chip assay with microarray analysis found 113 genes whose expressions are directly regulated by PIL5.
Interestingly, many transcription factors were included in the PIL5 direct regulated genes. This finding suggests that PIL5 induces transcription cascades in which transcription factors regulated by PIL5 regulate various downstream gene expressions. In addition, many hormone related genes were directly regulated by PIL5. Hence, PIL5 regulates not only GA and ABA metabolic and signaling gene expressions, but also other hormone (BR, Cytokinin and JA) metabolic and signaling gene expressions to inhibit seed germination in the dark.
식물에게 있어서 발아는 이후의 생장과 번식에 절대적인 영향을 미치기 때문에, 그것은 빛과 습도나 온도와 같은 다양한 외부 환경에 의해서 정교하게 조절된다. Red와 far-red 영역의 빛을 인지하는 광수용체인 파이토크롬은 이들 영역의 빛을 받아서 발아를 조절하는데 관여한다. 그러나 아직까지 파이토크롬이 어떤 신호전달 과정을 거쳐서 발아를 조절하는지에 대해서 잘 알려져 있지 않다.
본 연구에서는 파이토크롬과 직접 결합하는 PIL5라는 단백질이 발아를 조절하고 있음을 밝혀냈다. PIL5는 bHLH 전사조절 단백질로, 파이토크롬의 Pfr에 특이적으로 결합한다. PIL5는 발아뿐만 아니라 파이토크롬이 관여하는 하배축(hypocotyls) 생장 억제 그리고 하배축 음굴지성등도 관여하고 있었다. 유전자 발현 분석을 통해서 이 PIL5가 지베렐린 합성에서 중요한 기능을 담당하는 효소인 GA3ox1과 GA3ox2의 발현을 억제하고, 지베렐린 분해 과정에 관여하는 GA2ox2의 발현은 촉진한다는 것을 알게 되었다. 이 유전자 발현 양상과 일치하게, 실제로 씨앗 내부의 지베렐린 양은 PIL5 돌연변이체에서 높았고, PIL5를 과발현하는 형질전환체에서는 낮았다. 따라서 PIL5는 지베렐린을 합성과 분해 과정을 통해서 발아를 조절하고 있음을 확인할 수 있었다. 더 나아가 PIL5 단백질이 빛을 인지한 파이토크롬에 의해서 분해된다는 것을 보였다. 종합해보면, 어둠 상태에서는 PIL5가 씨앗 내부의 지베렐린 합성을 억제하여 발아를 막고 있다가, 빛이 들어오면, 이 빛이 파이토크롬을 통해서 PIL5 단백질을 분해하고, 그래서 PIL5는 지베렐린 합성을 억제하지 못하고, 결과적으로 발아가 진행된다는 그림을 그릴 수 있었다.
지베렐린 합성을 하지 못하는 ga1 돌연변이체를 이용하여, PIL5가 단지 지베렐린 합성 과정 뿐만 아니라, 지베렐린 신호 전달 과정에도 관여하고 있음을 보였다. 유전자 발현 분석을 통해서 PIL5가 지베렐린 신호 전달 과정에 관여하는 GAI와 RGA의 발현을 조절하고 있을 알게 되었다. 더 나아가 ABA 합성 과정과 분해 과정에 관여하는 유전자들 (ABA1, NCED6, 그리고 CYP707A2)의 발현도 PIL5가 조절한다는 것을 밝혔다. ChIP-chip assay를 통해서 PIL5가 GAI와 RGA의 프로모터에 위치하는 G-box motif에 직접 결합해서 그들의 발현을 조절하고 있음을 알게 되었다. 그러나 PIL5가 조절하는 다른 유전자들, 예를 들어 GA와 ABA 합성 유전자들의 프로모터에는 PIL5가 직접 결합하지 않았다.
PIL5가 직접 조절하는 유전자들을 더 찾기 위해서 ChIP-chip assay를 수행하였다. 이를 통해서 PIL5가 주로 G-box motif나 그것의 variants를 통해서 DNA에 결합한다는 것을 알게 되었다. 이 ChIP-chip assay와 microarray 분석을 비교해서, 총 113개의 유전자가 PIL5에 의해서 직접 조절됨을 확인하였다. 흥미롭게도 많은 전사조절 유전자가 이 113개의 유전자에 포함되었다. 이것으로부터 PIL5가 전사 다단계(transcription cascade) 과정을 거쳐서 많은 유전자의 발현을 조절할 것을 추측할 수 있다. 뿐만 아니라 많은 호르몬 관련 유전자들이 PIL5에 의해서 조절 받고 있었다. 이는 단지 GA와 ABA 합성, 신호전달 과정뿐만 아니라 BR, cytokinin 그리고 JA와 같은 다양한 호르몬의 합성, 신호전달 과정에도 PIL5가 관여하고 있으며, 아마도 이들 호르몬들을 조절해서 발아를 억제하고 있음을 암시한다.
