The signal pathway by which 14-3-3$\varepsilon$ inhibits cell migration induced by MAPK-activated protein kinase 5 (MK5) was investigated in cultured HeLa cells. Both in vivo and in vitro analyses have revealed that 14-3-3$\varepsilon$ interacts with MK5. Other MKs including MK2 and MK3 appeared to fail to interact with 14-3-3$\varepsilon$. 14-3-3$\varepsilon$ bound to MK5 inhibits the phosphorylation of HSP27, a known substrate of MK5. Disturbance of actin cytoskeleton organization by 14-3-3$\varepsilon$ was shown in transfected cells transiently expressing 14-3-3$\varepsilon$ as well as established cells stably expressing14-3-3$\varepsilon$. Moreover, overexpression of 14-3-3$\varepsilon$ resulted in the inhibition of cell migration induced by MK5 overexpression or TNFαtreatment. Results in this study suggest that 14-3-3$\varepsilon$ bound to MK5 inhibits cell migration by inhibiting the phosphorylation of HSP27 whose phosphorylation regulates F-actin polymerization, actin cytoskeleton organization and subsequent actinfilament dynamics.
14-3-3 단백질은 진화, 유전적으로 보존된 단백질로 말안장 모양의 homo-, heterodimer를 이루어 작용한다. 7가지의 isoform이 존재하며, 거의 모든 조직에 고루 분포하며 다량 발현된다. 대부분 14-3-3 표적 단백질은 14-3-3과 상호작용하기 위하여 14-3-3 binding motifs (RSXpSXp, RXXXpSXP)에 인산화를 필요로 한다. 그러나 몇몇 단백질은 인산화에 무관하게 14-3-3과 상호 작용한다. 14-3-3 단백질은 여러 receptor, kinase들에 결합하여 세포의 생장과 생체 반응에서의 다양한 조절을 하고, 14-3-3의 다양한 isoform들이 여러 방면에서 cell cycle의 엄격한 진행을 돕고 있다. 또한 Bad, FKHRL1, ASK1, Nur77과 같은 pro-apoptotic 단백질과 연관되어 apoptotic signal을 antagonize하는 것으로 알려져 있다. 이렇듯, 14-3-3 단백질은 세포 내에서 다양한 역할을 하며, 14-3-3의 엄격한 조절이 필요하다는 것을 예측할 수 있다. MK5 단백질은 serine/threonine 키나아제로 MAP 키나아제인 p38, ERK3/4에 의해 인산화되고, 그것의 기질로 HSP25와 HSP27 단백질이 있다. MK5의 세포 내 기능에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 연구에서는 14-3-3$\varepsilon$ 단백질 full-length를 사용하여, yeast two-hybrid를 수행하였고, 여러 가지 후보 단백질들 중 MK5에 관한 연구를 수행하였다. Yeast two-hybrid를 통하여 발견한 14-3-3$\varepsilon$과 MK5의 결합 가능성을 세포 내에서 면역침강법으로 확인하였다. 또한, MK5의 catalyticdomain인N말단 14-3-3$\varepsilon$과의결합에중요하다는 사실을확인하였다. 이러한 14-3-3$\varepsilon$과 MK5의 결합은 MK5 단백질 키나아제 활성을 억제 시키는 것을 kinase assay를 통하여 알 수 있었다. 14-3-3$\varepsilon$ 과발현은 MK5의 기질인 HSP27의 인산화를 억제시켰고, 14-3-3$\varepsilon$siRNA를통해14-3-3$\varepsilon$을 knockdown 시키면 HSP27의 인산화가 증가하는 것을 확인하였다. HSP27 인산화 저해로 인해 F-액틴 중합 반응이 감소하였고, 이로 인해 세포이동이 감소하는 것을 확인하였다. 본 논문은 14-3-3$\varepsilon$ 단백질의 actin cytoskeleton remodeling에 있어서 새로운 역할에 대한 이해를 제공할 것이다.
