Direct expression of an antimicrobial peptide (AMP) in Escherichia coli causes several problems such as the toxicity of AMP to the host cell, its susceptibility to proteolytic degradation and decreased antimicrobial activity due to the additional residue(s) introduced after cleavage of AMPs from fusion partners. To overcome these problems and produce a large quantity of a potent AMP histonin (RAGLQFPVGKLLKKLLKRLKR) in E. coli, an efficient expression system was developed, in which the toxicity of histonin was neutralized by a fusion partner F4 (a truncated fragment of PurF protein) and the productivity was increased by a multimeric expression of a histonin gene. The expression level of the fusion proteins reached a maximum with a 12-mer of a histonin gene. In addition, because of the RLKR residues present at the C-terminus of histonin, Furin cleavage of the multimeric histonin expressed produces an intact, natural histonin. The AMP activity of the histonin produced in E. coli was identical to that of a synthetic histonin. With our expression system, 167 mg of histonin was obtained from 1 L of E. coli culture. These results may lead to a cost-effective solution for the mass production of AMPs that are toxic to host.
자연계에 존재하는 거의 모든 생명체들은 외부균의 침입으로부터 자신을 보호하기 위한 1차적 방어물질로 항균 펩타이드를 이용하고 있음이 밝혀졌다. 항균 펩타이드는 기존의 항생제와는 달리 항생제 내성균에 대하여 저항성을 갖지 않는 특징 때문에 차세대 항생제로서 각광을 받고 있다. 강력한 항균 펩타이드인 동시에 항암 펩타이드인 히스토닌을 항생제 및 항암제로 개발하기 위해선 히스토닌의 대량 확보가 필수적이지만, 기존의 화학합성 방법을 이용한 대량생산은 경제적으로 비효율적이다. 따라서 본 연구에서는 대장균 내에서 히스토닌을 효율적으로 대량 발현시킬 수 있는 시스템을 개발하였다.
대장균 내에서 항균 펩타이드인 히스토닌만을 발현시키면, 작은 크기로 인해 발현율이 극히 적고, 그 자체가 대장균에 독성을 띨 수 있으며, 대장균내의 단백질 분해효소에 의해 분해될 수 있다는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해, inclusion body를 형성하는 fusion partner인 F4를 히스토닌 multimer에 fusion시키는 생산법을 개발하였다. 히스토닌 자체내의 RLKR 서열 때문에, furin은 히스토닌의 C 말단을 잘라, 불필요한 아미노산 잔기가 없는 intact한 히스토닌 monomer를 생산할 수 있다는 장점이 있다.
대장균 1L 배양으로부터 furin cleavage후에 167mg의 순수한 히스토닌이 얻어졌으며, 이와 같이 얻어진 재조합 히스토닌은 원래의 히스토닌과 동일한 항균활성을 나타내었다.
이 시스템을 이용하면, host에 독성을 띠는 항균 펩타이드의 효율적 대량생산이 가능할 것이다.
